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研究背景糖尿病视网膜病变(diabetes retinopathy,DR)是糖尿病的一种神经血管并发症,是成人主要致盲眼病之一。2017年,全球糖尿病患者人数达4亿人,预计到2030年,患病人数将翻一番。其中,超过三分之一的糖尿病患者,存在DR的临床症状。目前,DR治疗的有效方法主要有激光光凝术、玻璃体切除术及玻璃体腔内注射皮质类固醇或抗VEGF药物。虽然上述方法具有一定临床疗效,但均不能完全抑制DR的临床进展或逆转视网膜损伤。此外,频繁的眼内注射可能会引起神经退行性变和脉络膜毛细血管萎缩等风险,同时频繁眼科就诊会产生高昂的医疗费用。对患者而言可供选择的治疗方案是有限的,这使得寻找新药物成为一项紧迫的任务。中药是临床最常采用防治疾病的药物,应用中药治疗DR系中医临床重要手段之一,对于克服化药治疗DR的局限性发挥了重要作用。复视明胶囊(FSM)是一种中成药,由西洋参、黄芪、熟地、决明子、红花、珍珠、水蛭等12味中药材组成,2004年作为军队医疗机构院内制剂[兰联制字(2004)FP68095号]用于临床并证实,该方具有益气活血,滋阴补肾,通络明目的功能,适用于气虚血瘀、肝肾不足、脉络阻滞所致糖尿病视网膜病变,但缺乏治疗DR的系统药效学研究。研究目的本研究旨在探讨FSM对糖尿病视网膜病理改变的作用及其对氧化应激和炎性反应等的影响,并通过探索乙醛脱氢酶2(acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)对DR的保护作用及机制,进一步研究FSM是否可通过ALDH2通路,发挥其抗氧化应激和抗炎症的作用。研究方法1、复视明胶囊对大鼠糖尿病视网膜损伤的抗氧化和抗炎症作用选取健康雄性SD大鼠,采用6周高脂高糖饮食联合35 mg/kg链脲佐菌素(STZ)的方法,诱导糖尿病大鼠模型。糖尿病大鼠模型成功建立30天后,行全视野视网膜电图(ffERG)和光学相干断层扫描(OCT)检查,观察视网膜病变情况。根据暗适应OPs2波幅值,将糖尿病大鼠随机分为5组:模型组(DM)、羟苯磺酸钙阳性组(CaD)、复视明高剂量组(High)、复视明中剂量组(Medium)和复视明低剂量组(Low)。并选取年龄匹配的正常大鼠作为空白对照组(N)。以灌胃方式,分别给予各组大鼠相应药物干预42天,DM组和N组给予等体积生理盐水。采用ffERG、OCT、PCR、Western Blot和ELISA等方法,检测视网膜功能和结构,于mRNA和蛋白水平测定视网膜中血管内皮生长因子-α(VEGF-α)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)的表达,并测定一系列表征机体氧化应激、炎性反应和脂质代谢的血液生化指标,从而评估复视明胶囊改善糖尿病视网膜损伤的作用。2、ALDH2通过Sirt1/Nrf2通路对STZ诱导早期大鼠糖尿病视网膜损伤的作用选取24只健康雄性SD大鼠,单次腹腔注射STZ(60 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型。糖尿病大鼠随机分为Alda1(ALDH2激动剂)治疗组和二甲基亚砜(DMSO)组。于STZ注射前3天和STZ注射后30天,按照10 mg/kg的剂量,腹腔注射Alda1(或等体积DMSO)。于糖尿病大鼠模型建立后1、7和30天,从视网膜功能、结构和分子水平进行各项指标的检测。3、复视明胶囊通过ALDH2通路对STZ诱导大鼠糖尿病视网膜损伤的机制选取健康的雄性SD大鼠,单次腹腔注射STZ(60 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型。糖尿病大鼠模型建立60天后,随机分为糖尿病模型组(DM)、羟苯磺酸钙阳性组(DM+CaD)、复视明组(DM+FSM)、复视明+Alda1组(DM+FSM+Alda1)和复视明+Daidzin组(DM+FSM+Daidzin)。并选取年龄匹配的正常大鼠作为空白对照组(Control)。Alda1为ALDH2的激动剂,Daidzin为ALDH2的抑制剂。以灌胃方式,分别给予各组大鼠相应的药物进行干预,DM组和Control组给予等体积的生理盐水和DMSO。药物干预30天后,检测视网膜功能、结构,以及氧化应激、炎性反应相关分子。研究结果1、复视明胶囊对大鼠糖尿病视网膜损伤的抗氧化和抗炎症作用在DR大鼠中,与DM组大鼠相比较,复视明治疗组(1.0g/kg和0.5g/kg)明显改善视网膜功能(暗适应3.0反应b波和OPs2波)(P<0.01),并显著减少视网膜厚度的变薄,包括内核层(INL)、外核层(ONL)和总视网膜厚度(P<0.01)。同时,与DM组大鼠相比较,FSM(1.0g/kg和0.5g/kg)显著下调VEGF-α、GFAP和VCAM-1在视网膜组织中的表达水平(P<0.05)。FSM(1.0g/kg和0.5g/kg)显著增强血清中抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,而降低晚期糖基化终末产物(AGEs)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的水平(P<0.05)。2、ALDH2通过Sirt1/Nrf2通路对STZ诱导早期大鼠糖尿病视网膜损伤的作用OCT显示,Alda1治疗组的外核层(ONL)厚度和总视网膜厚度均大于DMSO组(ONL:7 d和30 d,P<0.05;总视网膜:30 d,P<0.05)。ffERG显示Alda1治疗组的暗适应3.0反应b波和OPs波幅值显著高于DMSO组(P<0.05)。此外,Alda1治疗组视网膜中肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的水平低于DMSO组(TNF-α:P<0.05;IL-6:1 d和7 d,P<0.05),而超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于DMSO组(P<0.05)。同时,与DMSO组比较,Alda1治疗组视网膜中ALDH2、沉默信息调节因子2相关酶I(Sirt1)和红系衍生核因子2相关因子(Nrf2)的表达水平明显升高(P<0.05),而血管内皮生长因子(VEGF-α)的表达显著下降(7 d和30 d,P<0.05)。3、复视明胶囊通过ALDH2通路对STZ诱导大鼠糖尿病视网膜损伤的机制ffERG显示,相比于DM组,DM+FSM+Alda1组的暗适应3.0反应b波、0.01反应b波和OPs2波幅值显著升高(P<0.01,P<0.01,P<0.05),暗适应3.0反应b波潜伏期显著缩短(P<0.05)。HE染色显示,与DM组比较,DM+FSM组和DM+FSM+Alda1组能显著减少视网膜ONL、INL和视网膜总厚度的变薄(P<0.05)。ELISA结果显示,DM+CaD组、DM+FSM组和DM+FSM+Alda1组视网膜中TNF-α和IL-6的表达水平低于DM组(P<0.05,P<0.01),而SOD活性显著高于DM组(P<0.01)。同时,免疫组化显示,与DM组比较,DM+CaD组、DM+FSM组和DM+FSM+Alda1组视网膜中ALDH2、SOD的表达水平明显升高,而VEGF-α的表达显著下降。研究结论1、FSM可改善糖尿病大鼠视网膜损伤,其机制可能与抗氧化、抗炎症作用有关。2、ALDH2可能通过增加Sirt1和Nrf2的表达来改善STZ诱导的早期老年糖尿病大鼠视网膜损伤。3、FSM可通过ALDH2通路,发挥其抗氧化应激和抗炎症的作用。