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目前在世界范围内,糖尿病(Diabetes mellitus,DM)影响超过4.25亿多人的生命健康,且全球患者数量还在逐年增多,已成为继心血管疾病、恶性肿瘤之后的第 3 号人类健康杀手.据国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation, IDF)统计,2017年中国糖尿病患者(20-79岁)为1.144亿,是全球糖尿病患者数量最多的国家,预计到2045年,中国糖尿病患者数量将达到1.198亿.糖尿病中以2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)最为常见,占糖尿病的90%以上.保守估计,全球每年花费在T2DM的医疗保健费超过了5000亿美元.骨骼肌是人体含量最多的组织,占整个身体重量40%左右,同时也是葡糖糖代谢的主要组织,大约有80-90%胰岛素刺激的葡糖糖的吸收在骨骼肌内进行.骨骼肌不是脂肪储存组织,但过多的脂质摄入引起骨骼肌中积累大量的脂滴(Lipid droplets,LD),导致骨骼肌异位脂质沉积(ectopic lipid deposition),引起骨骼肌胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR),从而与T2DM发病密切相关.因此,抑制骨骼肌中脂滴的异常聚积成为改善胰岛素抵抗和防治T2DM研究的一个重要切入点. 紫檀芪(Pterostilbene,PTT)是多酚类化合物中为数不多的一种芪类化合物,广泛存在于蓝莓、黑莓、葡萄等水果中,为白藜芦醇(Resveratrol,Res)的甲基化同系物,具有与Res相似的药理作用,但其生物活性、生物利用率、稳定性比Res更高,因而PTT的开发应用前景优于Res.已有研究发现,PTT可以通过促进骨骼肌细胞葡萄糖转运蛋白4 (Glucose transport protein 4, GLUT4)的表达促进骨骼肌吸收葡萄糖进而改善胰岛素抵抗,但PTT能否有效抑制高脂摄入引起的骨骼肌内异位脂质沉积尚未见研究报道.细胞质中的 LD 是一个独特中性脂存储结构,包膜为单层磷脂,主要包含甘油三酯(Triglyceride,TAG)和胆固醇(Cholesterol,CE),当体内游离脂肪酸(Free fatty acids, FFA)产生过多或骨骼肌线粒体合成或功能降低引起脂肪酸氧化减少都会导致骨骼肌细胞内甘油三酯(Triglyceride,TG)量增加,引起LD含量增加,而骨骼肌内TG堆积会导致"脂毒性"损伤作用,引起或加重IR,启动或促进T2DM的发病.围脂滴蛋白(Perilipin, Plin)是LD表面一种蛋白质标记物,目前已发现Plin1~Plin5五种脂滴蛋白,这些蛋白质共同的特点是在N端有100个序列高度同源的氨基酸,每种Plin蛋白都有其特定的组织分布,其中围脂滴蛋白5(Perilipin 5,Plin5)主要在心脏、肝脏以及骨骼肌中表达,具有调节脂质代谢的作用.成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growth factor 21,FGF21)是一种可由肝脏、内皮、骨骼肌等多种组织分泌的细胞因子,具有增加葡萄糖摄取,改善胰岛素抵抗的效应.最近有研究发现,Plin5 可以促进 FGF21 表达.此外,已有研究证实Res可通过激活肝细胞SIRT1促进FGF21表达,抑制肝细胞脂肪变性.综上分析,我们推测PTT可能通过调节Plin5/FGF21信号通路降低高脂诱导的骨骼肌异位脂质异位沉积并改善胰岛素抵抗. 本研究利用棕榈酸(Palmitic acid,PA)处理L6大鼠肌管细胞建立骨骼肌异位脂质沉积的体外模型,采用 CCK-8 法检测细胞活力,油红 O 染色和甘油三酯(Triacylglyceride,TG)检测试剂盒检测细胞内脂滴形成和脂质含量,荧光法检测胰岛素刺激下细胞对葡萄糖的摄取能力,PCR法和蛋白免疫印迹法检测细胞内相关信号分子的mRNA和蛋白表达水平,并通过siRNA技术沉默相关基因表达,深入研究Plin5-FGF21信号通路在PTT抑制高脂诱导的L6肌管细胞脂质沉积和胰岛素抵抗中的作用. 主要实验成果和结论如下: (1)使用不同剂量(10、20、40、60、80μmol/L)的紫檀芪对L6肌管细胞进行处理,细胞活性检测结果显示各剂量的紫檀芪对 L6 肌管细胞活力均无明显影响,表明本实验所用剂量的PTT对L6肌管细胞无细胞毒性作用. (2)0.75mmol/L的PA处理可导致 L6肌管细胞脂滴形成、TG含量明显升高,同时胰岛素刺激下的葡萄糖摄取能力显著下降;紫檀芪干预后 L6 肌管细胞中脂滴形成减少、TG 含量明显降低、胰岛素刺激下的葡萄糖摄取能力显著升高,提示紫檀芪干预可以有效抑制PA诱导的L6肌管细胞脂质沉积和胰岛素抵抗. (3)PA 处理呈剂量依赖性降低 L6 肌管细胞中 Plin5、FGF21 的蛋白水平;0.75mmol/L PA处理的L6肌管细胞经不同剂量PTT干预后,其Plin5、FGF21的表达水平呈剂量依赖性升高,提示 PTT抑制 PA诱导的 L6肌管细胞脂质沉积和胰岛素抵抗可能与其调节Plin5、FGF21的表达有关. (4)采用Plin5 siRNA转染沉默Plin5后,PTT对PA诱导的FGF21蛋白水平下降、TG 含量增加及胰岛素刺激下的葡萄糖摄取能力降低的抑制作用被明显削弱;而采用FGF21 siRNA转染沉默FGF21后,PTT对PA诱导的TG含量增加及胰岛素刺激下的葡萄糖摄取能力降低的抑制作用同样被显著削弱,提示Plin5/ FGF21通路在PTT改善PA诱导的L6肌管细胞异位脂质沉积和胰岛素抵抗中发挥了重要作用. 综上所述,本实验利用PA处理L6肌管细胞建立骨骼肌异位脂质沉积的体外模型研究证实PTT干预可通过调控Plin5/ FGF21通路抑制高脂诱导的骨骼肌异位脂质沉积并改善胰岛素抵抗.