论文部分内容阅读
植酸酶（肌醇六磷酸酶）是能够将植酸分解为肌醇和无机磷的一类酶的总称，在饲料工业上的应用可以提高单胃动物对饲料中磷的利用率，降低植酸磷对环境的污染，并降低饲料成本。此外植酸酶还可应用于医药、食品工业。微生物是植酸酶的主要来源，从微生物中筛选新的、性质优良酶蛋白是植酸酶研究的一个重要方向。本研究根据HAP类植酸酶的保守序列设计简并引物，从肠杆菌科微生物Hafnia alvei B125、Dickeya dadantii B187、Dickeyaparadisiaca B188菌中扩增出植酸酶基因片段，利用TAIL-PCR的方法得到了这三个基因的完整序列，分别命名为B125appA，B187appA，B188appA。此外根据鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）全基因组测序结果设计引物，通过PCR克隆得到另外一个植酸酶基因Y1appA。克隆的四个植酸酶基因之间的核苷酸一致性最高为75％（B187appA与B188appA），最低为48％（B188appA与B125appA，B188appA与Y1appA）。通过序列比对分析，B125appA编码蛋白与变形肥杆菌（Obesumbacterium proteus）来源的植酸酶氨基酸序列一致性为95％，虽然二者一致性较高，但它们在最适温度和热稳定性方面有较大的差异。B187appA和B188appA编码蛋白与软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora）中一个假定的磷酸酶蛋白氨基酸序列一致性分别达到53％和52％，与肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）来源的植酸酶氨基酸序列一致性分别为50％和49％。说明克隆得到的B187appA，B188appA为两个新的植酸酶基因。Y1appA编码蛋白与中间型耶尔森氏菌（Yersinia intermedia）来源的植酸酶氨基酸序列一致性为81％，二者在性质上有所差异。B125appA，B187appA，B188appA基因均在大肠杆菌中得到表达，Y1appA基因在酵母中得到表达，表达的植酸酶具有生物学活性。纯化四个酶并对酶学性质进行分析。B125r-APPA最适pH值为4.5，最适温度为60℃，pH稳定性好，从pH2.0到pH10.0剩余酶活均在80％以上，比活性为356.7 IU/mg，Km为0.49 mmol/L，Vmax为238 IU/mg。B187r-APPA与B188r-APPA最适温度均为55℃。都具有较好的pH稳定性，从pH4.0到pH9.0剩余酶活性为60％，其中从pH4.5到pH7.5剩余酶活性在100％。二者的最适pH值有所区别，B187r-APPA为5.5，B188r-APPA为4.5和5.5。B187r-APPA的比活性为642.64 IU/mg，B188r-APPA的比活性为768.8 IU/mg。B187r-APPA的Km为0.249 mmol/L，Vmax为833 IU/mg。B188r-APPA的Km为0.399mmol/L，Vmax为666IU/mg。Y1r-APPA具有较高的比活性，达到2346.09 IU/mg，是本研究四个酶中最高的。酶的最适pH值为4.5，酶在酸性条件下活性较高，在pH2.0时仍有80％的活性。这在细菌来源的植酸酶中不多见。最适温度为55℃。酶的pH稳定性很好，从pH2.5到pH10.0剩余酶活维持在80％以上。Km为0.208 mmol/L，Vmax为4403.35 IU/mg。据我们所知，目前尚无关于Hafnia与Dickeya属中发现植酸酶及其相关基因的的报道，本研究得到的四个植酸酶为植酸酶家族增添了新的成员。