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胸腺退化是引发免疫力下降和免疫衰老的重要因素之一。除年龄因素外，性别也是调节生理性胸腺退化和萎缩的重要原因。microRNAs（miRNAs）是一类在转录或转录后水平调节基因表达的非编码小 RNA分子，在动物的个体发育、细胞分化、组织器官的形成等过程中发挥重要作用。虽然已证实不同年龄小鼠胸腺退化过程中存在着差异表达的miRNAs，但是，在不同性别小鼠胸腺退化过程中是否存在着 miRNAs的差异表达未见报道。胸腺退化的性别差异无疑与体内性激素的调控直接相关，性激素对胸腺退化的调控主要通过作用于胸腺上皮细胞（Thymic epithelial cells, TECs）而实现。为进一步研究胸腺内miRNAs的表达对胸腺退化调节的重要性，我们应用高通量测序技术检测了TECs细胞中雌激素（Estradiol，E2）调节的miRNAs的表达谱，进一步筛选和分析关键miRNAs的表达对胸腺退化的调控机制。主要研究结果如下：
1.微阵列基因芯片结果显示，共检测出625种成熟体 miRNAs。其中，59个呈年龄差异性表达，28个呈性别差异性表达，10个miRNAs既呈显著年龄差异性表达又呈显著性别差异性表达。去除信号值较低的miRNAs表达，分别筛选出7个性别差异性表达miRNAs和18个年龄差异性表达miRNAs，其中3个既呈年龄差异性表达又呈性别差异性表达。
2. miRNAs归类分析结果表明，在 Age-effect组中，11个 miRNAs表达属于Young-biased miRNAs（3月龄表达>12月龄表达），7个 miRNAs表达属于Old-biased miRNAs（12月龄表达>3月龄表达）。Sex-effect组中，5个 miRNAs表达属于Female-biased miRNAs（雌性表达>雄性表达），2个miRNAs表达属于Male-biased miRNAs（雄性表达>雌性表达）。
3. qPCR验证结果与芯片检测结果表达趋势相符，其中miR-181c-5p、miR-20b-5p、miR-98b-5p、miR-329-3p、miR-341-5p和 miR-2137的表达被确认呈显著年龄差异性表达（p<0.05， p<0.01）；miR-27b-3p、miR-140-3p和miR-378a-3p被确认呈显著性别差异性表达（p<0.05，p<0.01）。
4. GO（Gene Ontology，基因本体分析）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）分析表明，小鼠胸腺退化过程中 Age-effect和Sex-effect组中miRNAs的表达共同或独立调控多条相关信号通路，主要涉及细胞增殖、凋亡、分化、疾病感染、肿瘤、免疫、应激、性激素调控等因素，这些因素对胸腺退化具有至关重要的影响。
5.胸腺组织中Old-biased miRNAs的表达主要与生理性应激和压力相关。性别差异miRNAs的表达与性激素的作用直接相关，其中miR-27b-3p和miR-378a-3p（p<0.05， p<0.01）受雌激素（Estradiol，E2）作用的调控。
6. TECs中 miRNAs表达的高通量测序结果表明，共鉴定出3,961种成熟体miRNAs，其中69个miRNAs的表达具有显著差异性，去除在两组中表达量都过低的miRNAs，共筛选出6个显著差异表达的miRNAs，包括4个下调miRNAs和2个上调miRNAs。
7. E2通过作用于雌激素受体α（Estrogen receptorα，ERα）调节TECs细胞中相关miRNAs的表达，这些miRNAs的表达与细胞增殖功能密切相关。
8.选定E2诱导上调的miR-16-5p研究其对TECs细胞增殖的调控机制。CCK-8和Edu结果显示，过表达miR-16-5p显著降低TECs细胞的增殖活力，抑制其表达后显著提升 TECs细胞的增殖活力；周期分析结果表明，过表达 miR-16-5p引发 TECs细胞G1/S期阻滞进而抑制细胞增殖；qPCR和Western blot结果表明，Cyclin D1和IGFBP3可能为其调控细胞增殖的关键靶基因。
9.靶基因验证结果显示，miR-16-5p对 Cyclin D1的3’UTR第1731~1737和1808~1814序列具有抑制作用；对IGFBP3的3’UTR的第360~366序列也有抑制作用，表明miR-16-5p通过调节靶基因Cyclin D1和IGFBP3的表达影响TECs增殖。
我们的研究结果表明，在胸腺组织水平上，不同性别小鼠胸腺退化过程中存在着差异表达的miRNAs，其中性激素对性别相关miRNAs的表达具有重要调节作用。在细胞水平上，E2通过ERα特异性调节TECs细胞中相关miRNAs的表达，这些miRNAs的表达与细胞增殖功能密切相关，这可能是不同性激素作用于TECs后导致不同性别小鼠胸腺退化差异的重要调节机制。本研究分别从组织水平和细胞水平研究了miRNAs表达对调控小鼠胸腺退化的重要性，因miRNAs是强大的基因转录后调节因子，为以后在分子水平深入揭示和研究胸腺退化的性别差异提供重要实验依据。
1.微阵列基因芯片结果显示，共检测出625种成熟体 miRNAs。其中，59个呈年龄差异性表达，28个呈性别差异性表达，10个miRNAs既呈显著年龄差异性表达又呈显著性别差异性表达。去除信号值较低的miRNAs表达，分别筛选出7个性别差异性表达miRNAs和18个年龄差异性表达miRNAs，其中3个既呈年龄差异性表达又呈性别差异性表达。
2. miRNAs归类分析结果表明，在 Age-effect组中，11个 miRNAs表达属于Young-biased miRNAs（3月龄表达>12月龄表达），7个 miRNAs表达属于Old-biased miRNAs（12月龄表达>3月龄表达）。Sex-effect组中，5个 miRNAs表达属于Female-biased miRNAs（雌性表达>雄性表达），2个miRNAs表达属于Male-biased miRNAs（雄性表达>雌性表达）。
3. qPCR验证结果与芯片检测结果表达趋势相符，其中miR-181c-5p、miR-20b-5p、miR-98b-5p、miR-329-3p、miR-341-5p和 miR-2137的表达被确认呈显著年龄差异性表达（p<0.05， p<0.01）；miR-27b-3p、miR-140-3p和miR-378a-3p被确认呈显著性别差异性表达（p<0.05，p<0.01）。
4. GO（Gene Ontology，基因本体分析）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）分析表明，小鼠胸腺退化过程中 Age-effect和Sex-effect组中miRNAs的表达共同或独立调控多条相关信号通路，主要涉及细胞增殖、凋亡、分化、疾病感染、肿瘤、免疫、应激、性激素调控等因素，这些因素对胸腺退化具有至关重要的影响。
5.胸腺组织中Old-biased miRNAs的表达主要与生理性应激和压力相关。性别差异miRNAs的表达与性激素的作用直接相关，其中miR-27b-3p和miR-378a-3p（p<0.05， p<0.01）受雌激素（Estradiol，E2）作用的调控。
6. TECs中 miRNAs表达的高通量测序结果表明，共鉴定出3,961种成熟体miRNAs，其中69个miRNAs的表达具有显著差异性，去除在两组中表达量都过低的miRNAs，共筛选出6个显著差异表达的miRNAs，包括4个下调miRNAs和2个上调miRNAs。
7. E2通过作用于雌激素受体α（Estrogen receptorα，ERα）调节TECs细胞中相关miRNAs的表达，这些miRNAs的表达与细胞增殖功能密切相关。
8.选定E2诱导上调的miR-16-5p研究其对TECs细胞增殖的调控机制。CCK-8和Edu结果显示，过表达miR-16-5p显著降低TECs细胞的增殖活力，抑制其表达后显著提升 TECs细胞的增殖活力；周期分析结果表明，过表达 miR-16-5p引发 TECs细胞G1/S期阻滞进而抑制细胞增殖；qPCR和Western blot结果表明，Cyclin D1和IGFBP3可能为其调控细胞增殖的关键靶基因。
9.靶基因验证结果显示，miR-16-5p对 Cyclin D1的3’UTR第1731~1737和1808~1814序列具有抑制作用；对IGFBP3的3’UTR的第360~366序列也有抑制作用，表明miR-16-5p通过调节靶基因Cyclin D1和IGFBP3的表达影响TECs增殖。
我们的研究结果表明，在胸腺组织水平上，不同性别小鼠胸腺退化过程中存在着差异表达的miRNAs，其中性激素对性别相关miRNAs的表达具有重要调节作用。在细胞水平上，E2通过ERα特异性调节TECs细胞中相关miRNAs的表达，这些miRNAs的表达与细胞增殖功能密切相关，这可能是不同性激素作用于TECs后导致不同性别小鼠胸腺退化差异的重要调节机制。本研究分别从组织水平和细胞水平研究了miRNAs表达对调控小鼠胸腺退化的重要性，因miRNAs是强大的基因转录后调节因子，为以后在分子水平深入揭示和研究胸腺退化的性别差异提供重要实验依据。