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本论文建立了EH的工程菌高密度发酵及蛋白分离纯化工艺,用所制得的蛋白冻干品研究并建立了部分质量控制标准,为EH新药的申报提供了坚实的基础。主要内容如下：建立了低出血抗凝新药EH的高密度发酵及其分离纯化工艺。150L发酵罐高密度发酵后,离心收集上清液,经超滤、两步阴离子交换层析,分离纯化目的蛋白EH。用Lowry法进行蛋白含量测定,分别以SDS-PAGE电泳、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)鉴定EH的纯度,凝块法分析EH及其裂解产物的抗凝活性,鲎试验法检测热源,<0.5EU/mg为合格。经过80h发酵后菌体OD600为410,菌体湿重达到420g/L。两步离子交换层析纯化后EH的纯度在97%以上。凝块法分析得出未裂解的EH蛋白无抗凝血酶活性,表明EH的N-末端肽段谷氨酸-脯氨酸-精氨酸(EPR)序列成功封闭了水蛭素(hirudin,HV)的抗凝活性。当EH被FXa因子裂解后可以释放出部分的抗凝活性,FXa与EH以摩尔比1：180,37℃生理盐水溶液中反应6h,裂解活性为256～512ATU/mg。所建立的EH生产工艺,操作简便,重复性好,适合用于大规模生产。参考2010年版《药典》(三部)和生物制品相关指导原则,对制得的EH冻干品(批号20100907)进行了蛋白含量测定、紫外吸收测定、纯度测定、抗凝血酶活性测定等质量标准研究。其中：EH蛋白含量经Lowry法检测是20.08mg/mL,符合拟定的大于20mg/mL的标准；EH蛋白用超纯水稀释至2mg/mL,在275nm处的最大吸收为0.52,定义EH蛋白紫外吸收峰为(275±3)nm；RP-HPLC对EH蛋白纯度的检测,洗脱梯度为0min 5%～30% 5min 30%～60% 35min 60%～100% 40min,进样量30μg,1.0mL/min的流速洗脱,所测冻干品平均纯度为96.73%,符合制订的纯度大于95%的标准,该方法稳定可靠,能够准确反应蛋白纯度；以EH裂解后对凝血酶的抑制活性作为其体外活性,采用Chromozym TH发色底物法检测。确定EH体外抗凝活性裂解方法为：选用牛FXa与EH的摩尔比为1：180,在37℃生理盐水溶液中反应6h。用该方法对EH冻干品进行体外活性检测,所测三次EH蛋白裂解活性分别为364,396,410ATU/mg,据此将EH的抗凝活性范围定义为400×(1±30%)ATU/mg。采用拟定的质量控制方法对制得的EH冻干品进行质量标准检测,结果均符合中国药品生物制品检定所对生物制品申报临床研究的相关规定。EH蛋白含量、紫外吸收、纯度、抗凝血酶活性检测方法的建立,为EH蛋白生产过程中的质量控制提供了依据,也为EH的成药性研究奠定了基础。