论文部分内容阅读
目的:脑发育过程中,长期精确的发育调控过程形成了脑独特的构造.Nischarin是近年来发现的一种新型蛋白。在现阶段,关于Nischarin的研究主要集中在抑制肿瘤细胞迁移、侵袭等功能,然而对于Nischarin在神经系统中所起作用方面的研究较少。活化激酶(P21-activated kinases, PAK)和LIM激酶(LIM kinases, LIMK)是Rho-GTPases家族的下游分子,对神经系统的功能有重要影响。有研究发现,Nischarin可以抑制PAKl和LIMK1的活性,并且通过Rho GTPase信号通路引发骨架蛋白重组,从而抑制肿瘤细胞迁移。近期研究还发现,Nischarin在大鼠脑组织中高度表达,并且在脑区的分布呈现区域化。探索脑正常发育过程的分子机制,对于神经系统相关疾病的诊断和治疗具有重要的意义。本实验研究Nischarin及其下游PAK, LIMK、confilin在大鼠脑发育过程中的变化及其意义。方法:采用western blot、荧光定量RT-PCR技术检测在鼠胚胎及出生后不同发育时间脑组织中Nischarin表达、PAK磷酸化、LIMK磷酸化及cofilin磷酸化水平的改变;免疫共沉淀等技术研究大脑皮层中Nischarin与PAK以及LIMK的互作关系;在Neuro-2a(小鼠脑神经瘤细胞)细胞上研究Nischarin磷酸化调控PAK、LIMK、cofilin的机制;通过细胞划痕技术研究PC-12(肾上腺嗜铬细胞瘤)细胞上Nischarin对细胞迁移能力的影响。结果:1)Nischarin的蛋白和mRNA水平在大鼠脑皮层、海马和小脑中,呈现发育第四周增高的趋势;2)PAK蛋白的磷酸化水平在大鼠脑皮层和海马发育过程中,在出生后14天至28天呈现减少的趋势;3)LIMK蛋白的磷酸化水平在大鼠脑皮层和海马发育过程中,在出生后14天至28天随发育进程呈现减少的趋势;LIMK蛋白的磷酸化水平在大鼠小脑发育过程中,在出生后14天与28天下降;4)cofilin蛋白的磷酸化水平在大鼠脑皮层和海马发育过程中,在出生后21天到28天磷酸化水平下降;5)大鼠大脑皮层中,存在PAK和Nischarin的稳定结合以及LIMK和Nischarin的稳定结合;6)Neuro-2a细胞上,Nischarin对PAK的磷酸化有直接抑制作用,但不能直接抑制LIMK和cofilin的磷酸化;7)在体外培养的神经细胞PC-12上Nischarin可抑制其迁移能力。结论:通过实验我们认为Nischarin可能通过调控PAK及其下游LIMK和cofilin蛋白的磷酸化以及调节神经元的迁移,参与大鼠脑的正常发育过程。