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目的:研究偶氮类染料及其金属配合物与蛋白质的相互作用,优化其作用条件,建立起几种检测蛋白质的新方法,同时对偶氮染料及其金属配合物与蛋白质的作用机理进行初步探讨.
方法:
分别用偶氮肿Ⅲ(ArsenazoⅢ)、偶氮胂Ⅲ-钡(Ⅱ)[ArsenazoⅢ-Ba(Ⅱ)]、偶氮氯膦Ⅰ-铁(Ⅲ)[(2PA-Ⅰ-Fe(Ⅲ)]、磺胺偶氮氯膦(SA-CPA)几种偶氮染料及染料.金属配合物作为光谱探针与蛋白质进行反应,用分光光度法研究偶氮染料-白质、金属配合物-蛋白质作用的光谱行为及最适合的反应条件(酸度、缓冲体系、表面活性剂及各种试剂的用量).通过线性试验、回收试验、干扰试验、方法对比试验、重复性试验及稳定性试验等对方法的线性范围、偶然误差、系统误差、稳定性及灵敏度等进行评价.应用于蛋白质样品测定,制定血清蛋白质检测的参考值范围.建立起以偶氮染料为显色剂的蛋白质检测方法.并采用摩尔比法探讨了染料及金属配合物与蛋白质作用的模型及最大结合数和结合常数.
结果:
1.偶氮胂Ⅲ与蛋白质的显色反应在非离子型表面活性剂聚氧乙烯月桂醚(Bnij-35)存在下的pH2.0的Britton-Robinson(B-R)缓冲溶液中,偶氮胂Ⅲ(Arse-nazoⅢ)与牛血清白蛋白(BSA)反应生成紫红色复合物,最大吸收波长在610nm处.表观摩尔吸光系数为3.60×10<5>L·mol<-1>.cm<-1>.线性范围在0~56.2mg/L,回收率为96.1﹪~103.6﹪,批内变异系数和批间变异系数(CV)分别为0.8﹪与2.0﹪,与双缩脲法比较相关性良好,Y=0.9882X+1.1007,r=0.9898.参考值为(62.9~80.8)g/L(x±2s).将几种试剂组合成单一试剂,所得的试剂稳定,操作简便快速,误差减小,重复性好,建立起灵敏的单一偶氮胂Ⅲ试剂测定血清总蛋白的方法.
2.偶氮胂Ⅲ-钡(Ⅱ)配合物光谱探针与蛋白质的相互作用在表面活性剂阿拉伯树胶(gum arobic)存在下的pH2.20Mcllvaine酸性溶液中,偶氮胂Ⅲ-Ba(Ⅱ)配合物与BSA发生反应形成三元复合物,引起吸收光谱发生红移,最大吸收峰在611 nm处,且吸收峰明显增高.摩尔吸光系数达<,ε611>=1.01×10<6>L·mol<-1>·cm<-1>,BSA的浓度在0~67mg/L范围内服从比尔定律.平均回收率为104.0﹪.该法灵敏度高,选择性好,用于实际血清样品总蛋白的测定,与双缩脲法相关性良好,回归方程为Y=0.988X+1.10,r=0.9898.建立起高灵敏检测蛋白质的方法.
3.偶氮氯膦Ⅰ-铁(Ⅲ)配合物与蛋白质的相互作用在pH2.80的Michaelis酸性溶液中,偶氮氯膦I(CPA-Ⅰ)与铁(Ⅲ)及BSA形成三元复合物,最大吸收峰在570nm.该法具有较强的抗干扰力,弥补了偶氮氯膦Ⅰ测定蛋白质干扰物质允许量低的问题.摩尔吸光系数<,ε570nm>=2.70x10<-5>L·mol<-1>·cm<-1>,线性范围宽,可达0~82mg/L.平均回收率为100.7﹪.用于人血清总蛋白的测定与双缩脲法相关性好,回归方程为Y=0.988X+1.10,r=0.9898.建立起抗干扰力强的血清蛋白质测定方法.
4.磺胺偶氮氯膦与蛋白质的相互作用在pH3.29的Wapole酸性缓冲溶液中,磺胺偶氮氯膦SA-CPA)与BSA发生反应,形成稳定的复合物,最大吸收波长由560nm移至670nm处,对比度达110nm.表面活性剂平平加可增加体系的稳定性.表观摩尔吸光系数为2.83×10<-5>L·tool<-1>·cm<-1>.蛋白含量在8.2~65.4mg/L范围内线性良好,回归方程为A=4.64×10<-3>C.0.015(C为蛋白浓度,mgL),r=0.9992.平均回收率为101.3﹪.用于血清总蛋白样品的分析与双缩脲法相关性好,Y=0.9760X+1.8703,r=0.9844.
结论:
偶氮类染料及其金属配合物与蛋白质的反应具有以下特点:
1.灵敏度高,摩尔吸光系数达10<5>L·mol<-1>·Cm<-1>.金属配合物[偶氮胂Ⅲ-钡(Ⅱ)]测定蛋白质较相应的染料(偶氮胂Ⅲ)具有更高的灵敏度,摩尔吸光系数可达10<6>L.mol<-1>.cm<-1>.
2.金属配合物测定蛋白质往往具有较强的抗干扰力.偶氮氯膦Ⅰ与蛋白质反应后,受各种离子等干扰大,给蛋白质的分析带来困难,偶氮氯膦Ⅰ-铁(Ⅲ)配合物对体液中的物质具有较大的允许量,可克服偶氮氯膦Ⅰ难于进行血清蛋白质测定的缺点.
3.偶氮类染料及其金属配合物与蛋白质在酸性条件下反应,因静电结合作用易产生沉淀,故必须选择合适的表面活性荆进行增稳.
4.反应速度快,室温条件下,10分钟内反应完全.
5.可用于多种蛋白质的检测,偶氮氯膦Ⅰ-铁(Ⅲ)配合物和偶氮胂Ⅲ-钡(Ⅱ)配合物除对BSA响应外,对溶菌酶也具有较好的响应.这几种方法均对血清总蛋白响应良好.
6.这几种方法用于血清总蛋白检测与双缩脲法相关性较好,且灵敏度较双缩脲法高,方法简便、快速、重复性好.
7.以磺胺偶氮氯膦和偶氮胂Ⅲ-钡(Ⅱ)为例,用摩尔比法研究了蛋白质与偶氮类染料及其金属配合物的结合模型及结合数.发现它们与BSA的作用基本符合Scatchard模型,结合数较大.