【摘 要】
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聚合酶链式反应（PCR）是现代分子生物学中的一项重要技术,它能够实现微量DNA在体外的快速扩增。随着PCR技术应用领域不断拓宽,PCR技术朝着高特异性、高延伸速率、高保真性方向发展,对PCR试剂的核心原材料——DNA聚合酶的也要求越来越高。为了提高KOD DNA聚合酶的PCR反应性能和耐抑制性能,本文针对性地对野生型KOD DNA聚合酶进行了分子改造,并研究了KOD DNA聚合酶突变体（KOFU-
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聚合酶链式反应（PCR）是现代分子生物学中的一项重要技术,它能够实现微量DNA在体外的快速扩增。随着PCR技术应用领域不断拓宽,PCR技术朝着高特异性、高延伸速率、高保真性方向发展,对PCR试剂的核心原材料——DNA聚合酶的也要求越来越高。为了提高KOD DNA聚合酶的PCR反应性能和耐抑制性能,本文针对性地对野生型KOD DNA聚合酶进行了分子改造,并研究了KOD DNA聚合酶突变体（KOFU-S）的酶学性质;在探究KOFU-S的PCR反应性能的基础上,将其应用在食品过敏原检测中,为食品过敏原的检测提供了一种可供选择的快速方案。主要的研究内容以及结果如下:（1）KOFU-S的重组表达。通过定点突变、结构域替换以及双链DNA结合蛋白Sso7d融合等技术手段,成功构建了重组耐热型DNA聚合酶KOFU-S的表达载体,实现了KOFU-S在大肠杆菌中的重组表达。经过优化后的诱导表达条件为:诱导温度为18℃,诱导时间为16 h,IPTG浓度为0.1 mmol/L。KOFU-S在大肠杆菌中的诱导表达产量为6.35 mg/L。采用Ni2+亲和层析技术到了电泳纯的KOFU-S储存液,其酶活浓度为4.69×10~4U/m L。（2）KOFU-S的酶学性质。通过对比研究不同条件下KOFU-S的DNA聚合酶活性,优化了KOFU-S的2×反应缓冲液组成:120 mmol/L Tris-HCl、260 mmol/L KCl、30 mmol/L（NH4）2SO4、3.6 mmol/L Mg Cl2、12%甘油,p H 9.6。KOFU-S经95℃加热4 h后,仍然具有50%以上的相对活性;分别在0-95℃孵育2 h后,KOFU-S的DNA聚合酶活性没有显著影响。而且,KOFU-S在PCR体系中的最适延伸温度为68℃。（3）KOFU-S的PCR反应性能。通过PCR反应产物的凝胶电泳分析以及蓝白斑法等对KOFU-S在PCR反应中的性能进行了研究。KOFU-S可以实现高保真(7.4×10-6)、高速率（5 s/kb）、高灵敏度（1μg/L）、长片段（10 kb）的PCR扩增,同时KOFU-S也具有很强的耐抑制剂能力,至少可耐受0.01%（w/v）的SDS,100 mmol/L的Na Cl,10%（v/v）的乙醇,160 mmol/L的尿素,80 mg/L的腐殖酸,0.03 U/m L的肝素以及0.8g/L的胆盐。（4）KOFU-S在食品过敏原检测中的应用。以大豆内源性基因Lectin和小麦内源性基因Gliadin为靶向基因,构建了基于KOFU-S直接扩增PCR检测食品中大豆、小麦过敏原成分的方法,其检出限为0.0001%（w/w）,远高于行业标准检出限0.01%（w/w）,检测灵敏度为0.4 mg/L。本文所建立的直接扩增PCR法适用于检测市售食品中大豆、小麦过敏原的检测。
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