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肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)的活化和增殖是肝纤维化发生的关键,活化的HSCs分泌大量I型前胶原(Precollagen I)、基质金属蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitors of matrix metalloproteinaseas, TIMP-1),活化的HSCs的凋亡是肝纤维化得以逆转的中心事件,故促进活化HSCs的凋亡是抗纤维化治疗研究的重要策略。核因子-κB (Nuclear factor-κB, NF-κB)作为一种广泛存在体内细胞的核转录调节因子,除能介导多种炎性介质转录表达外,它也参与细胞凋亡的调控,近年来研究认为NF-κB通路在诱导HSCs凋亡,逆转肝纤维化中有重要作用。一氧化氮(nitric oxide, NO)对基因表达调节作用是近年来发现的NO的一种新的生物学效应,文献报道NO可调控NF-κB活性,并可通过线粒体膜通路诱导HSCs凋亡,而NO通过NF-κB通路诱导HSC凋亡作用的机制尚未有人报道。本实验研究NO供体硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)通过NF-κB通路诱导HSC凋亡的作用,从而为临床应用该药物抗肝纤维化治疗提供了新的希望和理论基础。实验内容主要包括以下两部分:第一部分硝普钠对体外活化肝星状细胞增殖、凋亡的影响及其机制目的:研究硝普钠对体外活化肝星状细胞增殖、凋亡的影响及其机制。方法:应用体外HSCs培养技术,采用MTT方法测定HSCs增殖;碘化丙啶(propidium iodide, PI)标记的流式细胞术(flow cytometry, FCM)测定HSCs凋亡率,荧光显微镜及Hoechst33258荧光染色方法观察凋亡细胞的形态学改变;Real-time PCR方法检测Precollagen I、TIMP-1 mRNA表达。实验分组如下:①Control组,仅以含8%胎牛血清的DMEM细胞培养液培养细胞;②肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factorα, TNF-α)组,浓度为100ng/ml;③SNP组,加入浓度分别为1、5、10、20mmol/L SNP;④SNP+TNF组,先加10mmol/L SNP后再加100ng/ml的TNF-α。结果:①MTT方法测定显示不同浓度SNP对HSC-T6的增殖均具有明显抑制作用,随浓度增加,抑制作用增强,1、5、10、20mmol/L SNP与对照组相比,分别为(0.89±0.23),(0.50±0.13),(0.46±0.04),(0.36±0.09),(1.24±0.22),差异有统计学意义(P<0.05)。②碘化丙啶(PI)标记的流式细胞术显示SNP组HSCs凋亡率较对照组HSCs凋亡率有显著性差异(20.78±5.91% vs 3.25±1.26%, P<0.05);SNP组HSCs凋亡率较TNF-a组有显著性差异(20.78±5.91% vs 1.06±0.14%, P<0.05);SNP+TNF-a组HSCs凋亡率较TNF-a组有显著性差异(15.36±5.97% vs 1.06±0.14%, P<0.05),而对照组HSCs凋亡率较TNF-α组无明显差异(P>0.05)。③Hoechst 33258荧光染色显示:对照组HSC细胞核呈弥散均匀的荧光;SNP组部分HSC的细胞核出现浓染致密的块状或颗粒状荧光,提示细胞核浓缩、染色质凝集、DNA片段化,细胞出现凋亡。④应用Real-time PCR技术检测SNP对大鼠HSC-T6的TIMP-1、Precollagen I mRNA表达,可应用相对定量2-△△Ct法进行比较,以对照组(其mRNA的表达量为1)为标准,1、5、10mmol/L SNP Precollagen I mRNA相对于对照组的表达倍数分别为(0.80±0.17, 0.56±0.16, 0.43±0.15)倍,均显著低于对照组(P=0.004);1、5、10mmol/L SNP TIMP-1 mRNA相对于对照组的表达倍数分别为(0.67±0.35, 0.50±0.28, 0.37±0.27)倍,均显著低于对照组(P=0.003)。即随着SNP剂量不断增加,Precollagen I, TIMP-1 mRNA表达随之减少,提示SNP能抑制Precollagen I, TIMP-1 mRNA表达。结论:SNP能抑制HSCs增殖并诱导其凋亡,减少Precollagen I, TIMP-1 mRNA表达,从而减轻肝纤维化的发生、发展。第二部分硝普钠诱导TNF-α刺激的肝星状细胞凋亡的作用机制目的:探讨NO供体SNP诱导大鼠HSC-T6凋亡与NF-κB通路的关系。方法:激光扫描共聚焦显微镜检测荧光标记NF-κB P65的核移位;Real-time PCR方法检测抗凋亡蛋白基因( growth arrest and DNA damage-inducible protein, GADD45β)mRNA表达。实验分组如下:①Control组,仅以含8%胎牛血清的DMEM细胞培养液培养细胞;②肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factorα, TNF-α)组,100ng/ml的TNF-α作用1h;③SNP组,10mmol/L SNP;④SNP+TNF组,先加10mmol/L SNP 1h后再加100ng/ml的TNF-α刺激1h。结果:①激光扫描共聚焦显微镜观察,HSC-T6细胞株静息状态下NF-κB P65存在于细胞质,激活后转移到细胞核内。结果显示TNF-α组激活HSC NF-κB P65,SNP组抑制TNF-α介导活化的HSC NF-κB P65从细胞质转移到细胞核。②应用Real-time PCR技术检测SNP对大鼠HSC-T6的GADD45βmRNA表达,采用相对定量法2-△△C(t)公式进行比较,以对照组(其mRNA的表达量为1)为标准,1、5、10mmol/L SNP GADD45βmRNA相对于对照组的表达倍数分别为(0.43±0.20, 0.36±0.18, 0.26±0.07)倍,均显著低于对照组(P=0.001),即随着SNP剂量不断增加,GADD45βmRNA表达随之减少,提示SNP能下调抗凋亡蛋白基因GADD45βmRNA表达。结论:SNP诱导HSCs凋亡机制可能与通过抑制NF-κB活性,阻断下游靶基因GADD45β表达有关。