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单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种兼性胞内寄生的革兰氏阳性致病菌,可以引起人和动物流产、脑膜脑炎、败血症等症状,是一种对公共卫生安全和畜牧业生产危害较大的人兽共患病原菌,被世界卫生组织(WHO)认定为四大食源性致病菌之一。该菌广泛存在于自然环境中,对低温、高渗、酸性、碱性、消毒剂等外界环境具有广泛适应性,这种毒力和应激能力与其表达的毒力因子、环境应激因子以及相关调控分子密切相关。非编码RNA(nc RNA)作为一种调控分子可以通过调节毒力基因和环境应激相关基因的表达来影响LM毒力及其环境应激能力。目前,利用生物信息学及分子生物学技术在LM中已经鉴定出多种nc RNAs,这些nc RNAs与LM毒力、环境应激、金属离子转运、生物膜生成、糖代谢、侵染、胞内寄生等生命活动密切相关。Rli60属于LM nc RNAs中的成员之一,其功能至今尚不清楚。鉴于此,本研究利用同源重组技术构建rli60及nc RNA伴侣分子hfq基因缺失株,通过分析缺失株与母源株毒力和环境应激等表型差异并研究Rli60调控相关基因相对转录水平变化,以期揭示Rli60对LM毒力和环境应激的调控作用。研究方法和主要研究结果如下:1.LM nc RNA rli60和伴侣分子hfq基因的克隆、分子特征分析及其缺失株的构建与鉴定扩增、克隆LM-SB5 rli60及伴侣分子hfq基因并测序,对nc RNA Rli60二级结构、潜在作用靶点及hfq基因的分子特征进行分析。分别扩增rli60及hfq基因上、下游同源臂,采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)得到rli60和hfq基因缺失的融合片段△rli60和△hfq,构建具有氯霉素抗性的p KSV7-△rli60和p KSV7-△hfq重组穿梭质粒,电转化至LM-SB5感受态细胞中,在温度和氯霉素的双重选择压力下进行同源重组;筛选无氯霉素抗性的基因缺失株,并检测其遗传稳定性。利用q RT-PCR检测hfq基因缺失对rli60基因转录水平的影响。结果成功克隆了rli60和hfq基因,分析显示rli60基因全长246 bp,二级结构呈“X”型茎环结构,包含9个环状结构和5段互补的双链结构,其潜在作用靶点包括hly、inl F、dlt A、rsb U、glt D、mpl等与毒力及环境应激相关的基因。hfq基因全长234bp,编码77个氨基酸,对推导的Hfq氨基酸序列分析发现从N端到C端包含1个α-螺旋及5个β-折叠,具有RNA结合位点及六聚体结合位点,可能在参与LM nc RNAs调节基因表达过程中发挥重要作用。同时,成功构建并筛选得到遗传性稳定的基因缺失株LM-△rli60与LM-△hfq,重组缺失株经PCR鉴定得到与缺失后的预期值1543 bp及1421 bp相符的目的条带。在LM-△hfq中,rli60基因的相对转录水平为0.91,与LM-SB5相比其转录水平并无显著变化(p>0.05),表明Rli60在LM中可能通过不依赖于Hfq蛋白的方式发挥作用。2.nc RNA rli60基因缺失对LM环境应激及生物膜生成能力的影响为了解rli60基因缺失对LM-SB5环境应激能力及生物膜生成能力的影响,通过检测LM-SB5与LM-△rli60在不同温度、p H、高渗及乙醇条件下的环境应激能力及生物膜生成能力,并利用q RT-PCR检测生物膜生成相关基因glt B和glt C转录水平,分析rli60基因缺失对LM环境应激及生物膜生成能力的影响。结果发现,与LM-SB5株相比,LM-△rli60对30℃低温、42℃高温、碱性、3.5%乙醇环境应激能力及在48 h的生物膜生成能力显著减弱(p<0.05)。q RT-PCR检测结果显示,LM-△rli60中glt B基因的转录水平在24 h及48 h显著降低(p<0.05),glt C基因的转录水平在48 h显著降低(p<0.05),推测Rli60通过影响生物膜生成基因glt B、glt C的表达而导致生物膜生成能力下降。研究结果表明,nc RNA Rli60对LM环境应激及生物膜生成发挥了重要的调控作用。3.nc RNA rli60基因缺失对LM毒力的影响通过动物感染试验检测LM-SB5与LM-△rli60对昆明系小鼠的LD50,肝、脾载菌量及对肝、脾、肾的病理损伤;利用溶血试验及磷脂酶试验检测LM-SB5与LM-△rli60的溶血活性及磷脂酶活性;通过细胞侵染试验分析LM-SB5与LM-△rli60对小鼠巨噬细胞RAW264.7的黏附力、侵袭力、胞内生存增殖能力并利用q RT-PCR检测毒力基因相对转录水平,分析rli60基因缺失对LM毒力的影响。结果显示,与LM-SB5相比,LM-△rli60对昆明系小鼠的LD50上升了2.12个对数数量级,毒力显著降低(p<0.05);肝、脾载菌量显著下降;对肝、脾、肾的病理损伤也有所减弱。LM-△rli60较LM-SB5溶血能力下降了4倍;二者均具有一定磷脂酶活性。LM-△rli60对细胞黏附力显著升高,侵袭力及胞内的生存增殖能力显著降低(p<0.05);毒力基因相对转录水平也发生显著变化,其中prf A、inl A、inl B基因在LM-△rli60中相对转录水平升高,plc A、hly、act A基因在LM-△rli60中相对转录水平显著降低(p<0.05)。研究结果表明,nc RNA Rli60对LM毒力发挥了重要的调控作用。本研究通过同源重组方法构建了rli60基因缺失株LM-△rli60,并研究了rli60基因缺失对其环境应激能力和毒力的影响。与LM-SB5相比,LM-△rli60对低温、高温、碱性及乙醇环境应激能力显著降低,对小鼠毒力、细胞侵袭力、胞内生存增殖能力及溶血能力显著降低,证实Rli60对LM环境应激能力及毒力具有重要的调控作用。