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目的：探讨抗肝纤维化中药一扶正化瘀方抗肝细胞凋亡的作用机制与治法特点。
方法：本论文分为四部分。
1．脂多糖(LPS)和四氯化碳(CCl<,4>)诱导小鼠肝细胞凋亡病理特点比较。为体内实验部分，采用LPS和和CCl<,4>腹腔注射诱导在体肝细胞凋亡模型，24只雄性BALB/c小鼠分为正常组、LPS模型组和CCl<,4>模型组。观察小鼠肝组织大体病理；赖氏法测定血清肝功能(ALT、AST)；生化法检测肝组织过氧化损伤指标SOD、MDA；HE染色观察肝组织炎症和坏死病理变化；TUNEL染色观察肝组织肝细胞凋亡情况。以观察LPS和CCl<,4>诱导的在体肝细胞凋亡模型的病理特点。
2．扶正化瘀方及其拆方对在体肝细胞凋亡的作用机制与治法特点研究。为体内实验部分，采用LPS腹腔注射诱导在体肝细胞凋亡模型。60只雄性BALB/C小鼠分为正常组、模型组、扶正化瘀方组、扶正组、化瘀组和NAC组。扶正化瘀方组、扶正组、化瘀组和NAC组分别给予扶正化瘀方、扶正方、化瘀方和NAC灌胃3d后开始造模，正常组和模型组给予等剂量生理盐水。观察指标：生化法测定血清肝功能(ALT、AST)；肉眼观察小鼠肝脏大体病理；HE染色观察肝组织炎症、坏死病理变化；生化法检测肝组织过氧化损伤指标SOD、MDA；电镜观察肝细胞凋亡形态学变化；TUNEL染色观察肝细胞凋亡和计算凋亡指数；凝胶电泳检测肝组织DNA Ladder；蛋白印迹法检测TRAIL、TNF-R1、bcl-2、bax、bcl-xL、caspase 3等蛋白表达；荧光定量PCR法分析TNF-α、bcl-2和bax基因表达。
3．肿瘤坏死因子a(7NF-a)和LPS诱导体外培养的原代肝细胞凋亡模型的探讨。分离培养原代小鼠和大鼠肝细胞(HC)，于培养24h时，加入不同浓度TNF-a(10、20、40ng/ml)和Act D(50、100、200ng/ml)与原代小鼠肝细胞进行共孵育3、6、12h：或5、10、20、40mg/L LPS与原代大鼠肝细胞进行共孵育24h；光镜下观察细胞生长状态；MTT法检测原代肝细胞活力；Annexin V/PI联合染色或Hoechst33258或PI染色，激光共聚焦或荧光显微镜下观察肝细胞凋亡形态；流式细胞分析术定量检测肝细胞凋亡率；DNA凝胶电泳检测肝细胞DNA Ladder；生化法检测肝细胞培养上清ALT活性。
4．扶正化瘀方及其拆方影响原代肝细胞凋亡的作用机制及其治法特点。采用体外培养的原代小鼠细胞，加入TNF-a(20 ng/ml)/Act D(100 ng/ml)共孵育6h诱导细胞凋亡模型。原代肝细胞分为正常组、模型组、扶正化瘀方组、扶正组、化瘀组和NAC组。模型组、扶正化瘀方组、扶正组和化瘀组，分别加入正常大鼠血清和扶正化瘀方、扶正方和化瘀方药物血清，NAC组加入NAC，与肝细胞共孵育半小时后，加入TNF-a诱导凋亡。MTT法检测原代肝细胞活力；Annexin V/PI联合染色，激光共聚焦显微镜下观察肝细胞凋亡形态；细胞流式分析术定量检测肝细胞凋亡率；DNA凝胶电泳检测肝细胞DNA Ladder：蛋白印迹法检测TNF-R1、bcl-2、bax、bad、caspase 3等蛋白表达：荧光定量PCR法分析bcl-2、bax基因表达；化学比色法检测caspase 3活性。
结果:
1．与正常小鼠相比，CCl<,4>模型和LPS模型小鼠血清ALT、AST活性均明显升高，且LPS模型较CCl4模型升高明显；肝组织SOD活性明显下降、MDA含量明显增加，且CCl4模型较LPS模型为重；肝组织HE和TUNEL病理染色显示，CCl<,4>模型肝组织病变区域以中央静脉周围为主，可见肝细胞凋亡及坏死，炎性细胞浸润；LPS模型肝组织病变呈弥漫性，凋亡肝细胞分布于肝小叶各区，肝窦明显充血，肝小叶结构紊乱，伴肝细胞灶性坏死，炎性细胞浸润；光镜下计算各组小鼠肝细胞凋亡指数(Apoptosis Index，Al)，正常组Al为1.50±1.41％；CCl<,4>模型组Al为20.4±5.3％，LPS模型组Al为26.0±7.4％，但两模型组间无差异；而炎性细胞浸润和肝细胞坏死，LPS脂多糖模型较CCl4模型显著。
2．对于LPS诱导的整体肝细胞凋亡模型，扶正化瘀方及其拆方扶正组、化瘀组药物和NAC均能减轻肝细胞凋亡，同时降低血清ALT、AST活性和肝组织MDA含量，升高肝组织SOD活性，其中以扶正化瘀方疗效最好，其次为NAC、扶正组药物，化瘀组药物再次之。各药物组可抑制体内肝细胞凋亡的诱导因子表达，如TNF-a基因表达、TRAlL蛋白表达和脂质过氧化损伤等；纠正细胞内的促凋亡与抗凋亡信号传导分子的失衡状态，如下调TNF-R1蛋白表达，促进bcl-2基因与蛋白表达，抑制bax基因与蛋白表达，促进bcl-xL蛋白表达，抑制caspase 3蛋白表达，其中以扶正化瘀方作用最好，扶正组药物次之。
3．各剂量LPS与原代大鼠肝细胞进行共孵育24h，肝细胞形态无明显改变，MTT实验和细胞培养上清ALT活性检测显示LPS对肝细胞无明显毒性作用，且PI染色细胞流式分析各组间无显著差异。而TNF-a/ACt D共孵育肝细胞，随着TNF-a与Act D浓度增高，作用时间延长，肝细胞凋亡、坏死逐渐加重。当Act D 50ng/ml时，随着TNF-a浓度和作用时间增加，凋亡肝细胞较正常组增多，且以早期凋亡为主。如与10ng/mI TNF-a和肝细胞共同孵育6h时，肝细胞凋亡指数为29.1％；当Act D 100ng/ml时，随着TNF-a浓度和作用时间(同上)增加，凋亡肝细胞明显增多，其中以20ng/mI TNF-a和肝细胞共孵育6h时肝细胞凋亡率约为59％；当Act D 200ng/ml时，随着TNF-a浓度和作用时间增加，中晚期凋亡肝细胞和坏死肝细胞明显增多。
4．对于TNF-a诱导的体外原代肝细胞凋亡模型，肝细胞凋亡指数(Al)为51.93％，而各药物药物血清均能减轻肝细胞凋亡，扶正化瘀方组Al为25.51％，扶正组Al为37.55％：化瘀组Al仍达48.9％，加入20mM NAC共同孵育时，NAC组Al亦下降至31.22％。扶正化瘀方能抑制促凋亡因子TNF-R1、bax、bad和caspase3的表达与活性，同时促进抗凋亡因子bcl-2的表达。扶正组和化瘀组药物亦能影响以上不同的信号分子，从而发挥抗肝细胞凋亡作用。
结论:
1．LPS与CCl4诱导的肝损伤模型小鼠均有明显的肝细胞凋亡，LPS模型肝组织病变部位呈弥漫性，炎性反应较重，伴有明显的肝细胞坏死；而CCl4模型肝组织病变部位以中央静脉区为主，脂质过氧化损伤较明显。
2．TNF-a/Act D与小鼠原代肝细胞共孵育，可以建立体外肝细胞凋亡模型，其特点是随着浓度增加和时间延长，肝细胞将逐渐经历3个阶段一早期凋亡、中晚期凋亡和坏死为主的阶段；而在一定浓度(<20mg/L)和作用时间(24h)内的L,PS不能直接诱导大鼠原代肝细胞凋亡。
3．扶正化瘀方具有抑制整体模型和体外培养肝细胞的凋亡作用，在该方及其拆方的抗肝细胞凋亡作用中，扶正化瘀方作用最好，扶正组次之，扶正和化瘀2种中医治法具有协同配伍作用。扶正化瘀方抗肝细胞凋亡的作用机制与下调胞外促凋亡因子 TNF-α、TRAIL和过氧化损伤，上调胞内抗凋亡因子bcl-2、bcl-xL表达，下调促凋亡因子TNF-R1、Bax、Bad、Caspase 3表达有关。