第一部分:重组人促血小板生成素用于一线治疗无效的妊娠合并ITP患者治疗的临床研究原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia,ITP)是一种以暂时或持续性血小板减少为特征的免疫性疾病,约占出血性疾病的1/3,是临床最常见的自身免疫性出血性疾病。自身抗体导致的血小板破坏增加或血小板生成不足均可导致ITP。ITP是早孕阶段最常见的血小板减少性疾病,在孕期血小板减少病例中约占5%。严重的血小板减少(血小板计数<20×109/L)的病人有自发性出血、产后出血及胎盘早剥的危险。抗血小板IgG型自身抗体能够透过胎盘屏障从而导致新生儿暂时性血小板减少。若母亲怀孕期间患有ITP,约8.9%到14.7%的新生儿有严重的血小板减少,有约1.5%的新生儿出现颅内出血(intracranial hemorrhage,ICH)。妊娠合并ITP的一线治疗方案与非妊娠ITP患者治疗方式相同,均为糖皮质激素和(或)静脉注射丙种球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG)。近期一项回溯性研究报导显示,在妊娠合并ITP的患者中,糖皮质激素或IVIG治疗有效率小于40%,低于非妊娠患者。重组人促血小板生成素(recombinant human thrombopoietin,rhTPO)是一种糖基化的全长的促血小板生成素(thrombopoietin,TPO),分子量约为90000道尔顿。rhTPO是一种重组的c-Mp1配体,其氨基酸序列与内生TPO相同,但糖基化程度更高。在人及动物模型中rhTPO均被证明能有效升高血小板。rhTPO已被中国食品药品监督管理局批准用于治疗一线治疗无效的慢性ITP。多中心随机临床试验显示,在60.3%的糖皮质激素抵抗型的患者中rhTPO能快速升高血小板数量。本研究应用多中心、开放性、前瞻性的研究方法,研究rhTPO用于妊娠合并ITP治疗的的疗效及rhTPO对孕妇及胎儿健康的影响。研究目的:本试验为多中心、开放性、前瞻性、单臂试验,旨在研究rhTPO用于治疗激素和(或)IVIG抵抗的妊娠合并ITP的安全性及有效性。研究方法:1.入选标准为依照临床规范诊为ITP的18至50岁之间的孕妇;伴随有出血症状;激素和(或)IVIG治疗无效(入组时可伴维持量激素治疗);两次血小板输注治疗后,血小板计数增量小于10×109/L;孕妇血小板计数低于30×109/L;孕龄大于12周。2.所有参加试验的患者均给与初始计量300U/kg的rhTPO治疗,给药方式为皮下注射,每日一次,连续14天,随后进入维持治疗阶段。由于孕妇有高凝倾向,妊娠合并ITP患者仍有血栓形成的风险,为了避免血栓形成,维持治疗阶段rhTPO用量根据患者血小板计数调整。3.试验的首要终点为治疗第14天时受试者血小板计数是否大于30×109/L。完全缓解(completeresponse,CR)定义为血小板计数至少为100×109/L且没有出血症状。部分缓解(response,R)定义为血小板计数大于30×109/L且为用药前血小板计数的至少两倍。无反应(nonresponse,NR)定义为血小板计数小于30×109/L。次要终点为:母亲或新生儿中严重的不良反应;出生时新生儿的血小板计数,对有血小板减少的新生儿,还应于出生后第3、7、42天进行血小板计数;死产;早产(未满37周);低体重儿(出生体重不足2.5kg)。4.怀孕期间,每周对受试者进行有效性和安全性监测。分娩后每四周检测一次,直至分娩后24周。新生儿的健康指标及发育状况由儿科医生每月评价一次。5.出血评分:在受试者入组后第1天及第14天评估出血评分,以评价其出血严重程度,评价标注参照Gruppo Italiano Malattie Ematologiche dell’AdultoITP工作组提出的标准。6.本试验收集首次注射4周后、rhTPO治疗结束后、分娩6个月后受试者的血清,以酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测受试者是否产生抗rhTPO抗体,若产生抗体则进一步检查抗体是否具有中和性。7.数据分析所有接受过至少一次rhTPO注射的受试者均纳入安全性分析。所有数据应用 Statistical Package for the Social Sciences(SPSS)软件 22.0 版进行统计学分析。结果1.病人资料在2015年3月20日至2015年11月17日间,共有32名诊为孕期ITP的患者入组,其中一名患者在接受初次治疗前诊断由ITP更改为再生障碍性贫血,故实际入组人数为31人。所有31人均在产后接受了 24周的随访。新生儿的中位随访时间为53周(范围39至68周)。入组时,入组对象的中位年龄为26周岁,入组时的中位孕龄为24周(IQR,16至27周),基础血小板计数的中位数为10×109/L(IQR,6～12×109/L)。23名患者于妊娠前即诊断为ITP,占入组人数的74.2%(23/31),8名患者于妊娠期间诊为ITP(25.8%,8/31)。入组的ITP患者均接受过一线治疗且治疗无效。2.疗效在31位入组者当中,23位患者治疗有效(74.2%治疗有效),其中有10名患者达到完全缓解,13名为部分缓解。其余8位患者治疗无效,尽管他们的血小板计数也有所上升但并未达到部分缓解标准。出血情况方面,31位入组者当中26人的出血症状有所改善。停止rhTPO给药后,受试者的血小板计数逐渐减低,在停药4周和12周时的无复发生存率(即血小板计数大于30×109/L)分别为69.6%(16/23)和21.7%(5/23)。3.安全性受试者对rhTPO耐受良好,无严重不良反应发生,轻微副反应有眩晕、疲劳、注射处疼痛各1例。在治疗及随访期间,未发生先前未报道的不良反应,未发生因不良反应而退组的病例。未发生产科事件,未测出抗TPO自身抗体。全部31名新生儿当中,在中位53周(范围39～68周)的随访期内,无先天性疾病或发育迟滞报导。结论本试验证实rhTPO可成为一种安全有效起效迅速的妊娠合并ITP治疗方案,用于一线治疗无效且血小板输注治疗抵抗的妊娠合并ITP患者的治疗。本试验为进一步研究rhTPO及其他促血小板生成药物应用于孕期管理提供了依据。第二部分:抗GPlb单克隆抗体促血小板凋亡的研究研究背景原发免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP),是临床上最为常见的出血性自身免疫性疾病,约占临床出血性疾病的30%,以外周血中血小板数目减少为特点,症状轻者可无出血症状,严重者发生颅内出血,可危及生命。ITP患者免疫失耐受,产生了针对血小板糖蛋白GPIIb/IIIa及GPIb/IX的自身抗体,20-40%的ITP患者有抗GPIb复合物的自身抗体。凋亡也是血小板清除的重要途径,用抗GPIb自身抗体导致ITP的患者的血浆孵育健康的血小板,观察到有血小板凋亡现象。由此可见,GPIbα和凋亡均在ITP的发病机制中起重要作用。本研究应用抗GPIbα单克隆抗体(monoclone antibody,mAb),利用Balb/c小鼠建立被动免疫ITP动物模型,研究抗GPIbα抗体同血小板凋亡的关系,探索造成ITP的可能的机制。方法一、NITG能否不通过Fc段或F(ab)2结构引起血小板减少1.IVIG能否缓解GPIbα单抗所引起的血小板减少将WT Balb/c小鼠分为四组,分别为IVIG+NIT G组,IVIG+NIT B组,PBS+NIT G组,PBS+NIT B组。于实验第一天(D0)注射 10%IVIG,抗GPIb单克隆抗体NITG或NITB于一日后(D1)注射。观察各组小鼠血小板变化情况。2.单价NITG Fab可否引起血小板减少给WTBalb/c小鼠分别尾静脉注射完整的NITG抗体(1.5μg/只)、NIT GFab(1.0μg/只)及PBS(1.5μg/只),以每只小鼠注射前的血小板计数为基准,计算注射后每日血小板占基数的百分比。二、NITG及单价NITG Fab是否可导致血小板凋亡1.NIT G及NIT G Fab可否引起PS暴露给WTBalb/c小鼠分别尾静脉注射IgG(作为空白对照,1.5μg/只)完整的 NIT G 抗体(1.5μg/只)、NIT G Fab(1.0μg/只)及 NIT B(1.5μg/只)。24h后收集小鼠PRP,用Annexin V染色,流式细胞仪检测PS暴露情况。2.NIT G 及 NIT G Fab 对 Caspase-3 激活的影响给WTBalb/c小鼠分别尾静脉注射PBS(100μL/只)、完整的NITG抗体(1.5μg/只)、NITGFab(1.0μg/只)及 NIT B(1.5μg/只)。24h 后收集小鼠PRP,用FAM-FLICAcaspase3/7试剂盒染色,流式细胞仪检测caspase-3激活情况。2.NITG对血小板蛋白磷酸化的影响所有待检测抗体(1μL)同野生型Balb/c小鼠的PRP(100μL)共同孵育1h后离心,沉淀上样,用4G10测蛋白磷酸化情况。三、在高剪切力下,抗GPIbα抗体能否引起小鼠血小板活化将抗体同PRP共同孵育30分钟,将15μLPRP上样,用锥板粘度计施以剪切力。用流式细胞术测定P-selectin暴露情况。结果一、NITG可不通过Fc段或F(ab)2结构引起血小板减少1.IVIG能缓解NITB引起的血小板减少而不能缓解NIT G所引起的血小板减少对比IVIG+NIT G组与NIT G组,IVIG+NIT B组与NIT B组,结果表明IVIG可以改善由NITB引起的血小板减少,但不能缓解由NITG引起的血小板减少。说明NITG可能是通过非Fc受体依赖途径引起的血小板减少。2.单价NITG Fab可引起血小板减少注射4小时后,注射了 NITG和NITGFab小鼠血小板即出现减低,24小时后注射了 NIT G及NIT G Fab的小鼠血小板明显减低,后逐步回升,至第4日基本恢复到正常水平。说明NITG不仅可不依赖Fc段而且不需要F(ab)2结构就能够造成血小板减少。二、NIT G及单价NIT G Fab可导致血小板凋亡1.NIT G及NIT G Fab可引起PS暴露NIT G及NIG Fab可以使血小板表面PS暴露增加,而NIT B则没有(P=0.0162,0.0170,0.2886)。PS暴露是细胞凋亡的标志之一,是“clear me”信号,会导致凋亡细胞被清除。NIT G和NIT G fab可能会导致血小板凋亡,从而引起血小板减少。2.NIT G 及 NIT G Fab 使 Caspase-3 激活增加结果显示同对照组相比NIT G及NIG Fab可以使血小板内caspase-3激活增加(P=0.0101,0.0143)。而NITB组的结果则差异不具显著性(P=0.0828)。Caspase-3是凋亡通路上重要的分子,说明NIT G及NIT G Fab可能是通过激活凋亡通路导致血小板凋亡的。3.NIT G可抑制JAK2磷酸化水平在体外将WT Balb/c小鼠的血小板同不同抗体共同孵育,用4G10通过Western Blot检测血小板内蛋白酪氨酸磷酸化情况,发现在120KD左右的条带有差异。用抗磷酸化JAK2抗体pTyr1007检测证实该条带为JAK2,NIT G可抑制 JAK2 磷酸化(P=0.018),而 NITB,NIT E则同对照组无明显差异,(P均>0.05)。三、在高剪切力下,抗GPIbα抗体不会引起小鼠血小板活化检测发现,在高剪切力下,抗GPIbα抗体NITA、NITB、NITG并不能使WT Balb/c小鼠血小板表面p-selectin增加。结论1.抗GPIbα单克隆抗体NITG及单价NITG Fab可引起血小板凋亡,且不依赖F(ab)2结构及Fc段,即不需要抗体交联。2.NITG及NITGFab可能通过抑制JAK2磷酸化导致血小板凋亡。