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下丘脑是调节能量平衡和生殖的主要神经中枢,下丘脑结构复杂,内含许多神经核团,不同核团之间会构成复杂的调控网络,其中主要包括下丘脑背内侧核(dorsal medial hypothalamic nucleus,DMH)、下丘脑腹内侧核(ventromedial hypothalamic nucleus,VMH)、下丘脑室旁核(paraventricular hypothalamic nucleus,PVH)以及弓状核(arcuate nucleus,ARC),这些下丘脑区域都参与调节能量平衡和生殖功能。并且有关能量平衡和生殖的调节是相互关联的。促性腺激素抑制激素(gonadotropin inhibitory hormone,GnIH)是在日本鹌鹑脑中发现的一种新的RF酰胺肽,因其具有抑制促性腺激素释放的功能,而被命名为促性腺激素抑制激素。GnIH/RFRP-3(RFamide-related peptide-3,RFRP-3)神经元胞体主要位于PVH、VMH及DMH,而其神经纤维能够投射到很多区域,其中包括ARC。同时GnIH/RFRP-3是一种多效性激素,在摄食、能量平衡和生殖等方面发挥着重要作用。近年来研究显示GnIH是一种负性调节生殖和刺激食物摄入的神经肽。阿片-促黑素细胞皮质素原(pro-opiomelanocortin,POMC)是位于弓状核中重要的食欲调节肽,它是一种前体蛋白,经特异性蛋白酶水解后,会生成许多与能量平衡和食物调节相关的小分子多肽。近年来研究表明POMC具有抑制食物摄取和刺激生殖的作用。同时发现GnIH/RFRP-3具有抑制POMC神经元的作用,并且二者存在突触联系,而且GnIH/RFRP-3对POMC神经元的抑制作用,与GnIH/RFRP-3刺激食物摄取的效应相一致。但是GnIH/RFRP-3是否通过直接作用于POMC神经元而发挥调节作用,目前国内外还未有明确定论。本课题将对此进行验证研究。目的:通过免疫荧光法观察GnIH/RFRP-3与POMC在大鼠下丘脑神经元的表达,免疫共沉淀法(co-immunoprecipitation,CO-IP)观察GnIH/RFRP-3与POMC是否存在相互作用,蛋白印迹法(Western Blotting)检测侧脑室微量注射GnIH/RFRP-3作用不同时间后大鼠下丘脑组织中POMC蛋白的表达变化情况,以此初步探讨GnIH/RFRP-3是否通过POMC神经元而发挥作用。方法:1.实验动物分组:65只成年雌性SD大鼠,随机选取2只用于免疫荧光双标实验,随机选取3只用于免疫共沉淀实验,余下60只建立卵巢摘除术补充雌激素(ovariectomized estrogen primed,OEP)大鼠模型,模型组随机分成注射GnIH实验组和生理盐水对照组(GnIH及生理盐水分别4μl),每组30只。每组根据注射时间不同分为20、40、60、120、240、360 min等共6个亚组,每组5只。2.采用尼氏染色法观察大鼠下丘脑各核团。3.采用免疫荧光双标法观察GnIH/RFRP-3与POMC在大鼠下丘脑神经元的表达。4.采用CO-IP检测GnIH/RFRP-3与POMC的相互作用。5.采用Western Blotting法检测侧脑室微量注射GnIH/RFRP-3作用不同时间后,下丘脑组织中POMC蛋白的表达变化情况。结果:1.参考大鼠脑立体定位图谱,在尼氏染色镜下可看到下丘脑背内侧核、下丘脑腹内侧核和下丘脑弓状核。2.免疫荧光双标结果显示,GnIH/RFRP-3神经元与POMC神经元都为胞浆着色,GnIH/RFRP-3荧光为红色,POMC荧光为绿色,核仁为蓝色,GnIH/RFRP-3与POMC共表达于同一神经元。3.CO-IP结果显示,用POMC抗体与大鼠下丘脑组织裂解液总蛋白进行免疫共沉淀,免疫复合物电泳转膜后,分别用POMC抗体和GnIH/RFRP-3抗体进行免疫印迹,结果显示免疫复合物中含有POMC蛋白和GnIH/RFRP-3蛋白,且免疫印迹中出现条带与大鼠下丘脑组织裂解液中相应蛋白的条带位置一致。4.Western Blotting结果显示,组间比较,侧脑室微量注射GnIH/RFRP-3后20 min组大鼠下丘脑POMC蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05),注射40 min组(P>0.05)差异无统计学意义,注射60、120、240和360 min实验组大鼠POMC蛋白表达显著低于对照组(P<0.05);组内比较,与20 min实验组相比,60、120和240 min组蛋白表达量依次呈下降趋势,360 min组蛋白表达量有升高趋势但是仍然低于20min组,(P<0.05)差异有统计学意义。结论:GnIH/RFRP-3可能通过直接作用于POMC神经元而发挥作用。