本论文研究内容为国家自然科学基金项目“丹参茎叶改善血液循环和调控炎症反应的效应物质基础与分子机制研究”的一部分,在前期研究基础上,主要围绕丹参茎叶有效部位的提取制备工艺优化、质量控制、改善血液循环及其作用机制等进行研究,以期为丹参茎叶的进一步开发利用提供科学依据。主要研究内容及结果简述如下:一、文献研究1.通过总结中药标准提取物在国内外药典中的收录情况及专利申请现状揭示中药标准提取物的开发现状,对国内中药标准提取物质量标准现状进行归纳,从中药标准提取物质量标准和出口的发展趋势分析存在的问题,并提出解决思路,为中药标准提取物的进一步发展与扩大国际市场占比提供依据。2.整理分析了微循环与传统中医理论“血瘀证”之间的关联关系,归纳了各组织器官微循环的特点及微循环障碍在各器官中的表现特征,对微循环障碍的检测技术进行总结分析,并论述了微循环障碍的发病机制与中医治疗微循环障碍的研究进展。二、丹参茎叶酚酸和黄酮有效部位制备工艺优化研究1.丹参茎叶酚酸和黄酮有效部位提取工艺优化研究以丹参茎叶中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-0-芸香糖苷、紫云英苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C等13种资源性化学成分的总含量为评价指标,通过UPLC分析,考察提取次数、提取时间、溶媒倍数、溶媒浓度4个因素对提取工艺的影响,应用Box-Behnken响应面法采用四因素三水平的分析方法对丹参茎叶的提取工艺进行优化设计。最终得到最优提取工艺为60%乙醇10倍量回流提取3次,每次提取1.0h,经验证该工艺稳定可靠。2.丹参茎叶酚酸和黄酮有效部位纯化工艺优化研究在丹参茎叶酚酸与黄酮提取工艺确定的基础上,应用UPLC法分析丹参茎叶酚酸和黄酮有效部位的纯化工艺。根据吸附量和解吸率,筛选不同极性的9种大孔树脂,单因素考察上样量、上样浓度、洗脱剂浓度、洗脱剂体积,确定最优纯化工艺为每10g干燥NKA-2树脂上样2.5g生药,0.25g/mL药液浓度上样,60%乙醇溶液洗脱4BV,纯化后丹参茎叶酚酸和黄酮有效部位的纯度可达到51.49%(其中酚酸46.77%、黄酮4.72%)。三、丹参茎叶酚酸和黄酮有效部位质量标准研究1.丹参茎叶酚酸和黄酮有效部位薄层定性分析对6批不同产地的丹参茎叶提取纯化后,对酚酸与黄酮有效部位通过薄层色谱法鉴定分析,样品和丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、芦丁、异槲皮苷对照品溶液使用GF254薄层板,以醋酸丁酯-甲酸-水(10:2:3)为展开剂展开,在365nm下检视,6批样品与对照品在对应位置有相同颜色斑点,清晰且分离度好,为丹参茎叶酚酸和黄酮有效部位的质量控制提供科学依据。2.丹参茎叶酚酸和黄酮有效部位指纹图谱研究基于HPLC技术使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”建立丹参茎叶酚酸和黄酮有效部位的指纹图谱并分析相似度。结果显示,图谱中各峰分离度良好,这6批样品的HPLC色谱相似度在0.934～0.997之间,确定了 1 1个共有峰,共有峰的相对保留时间RSD值均不超过2.0%,相对峰面积中5和11号峰的相对峰面积的RSD值均大于80%,表明样品间成分组成基本一致,但受环境影响,成分含量有所不同。本实验建立的指纹图谱可用于评价与控制丹参茎叶有效部位的质量,高效简便,促进丹参茎叶资源开发利用。3.丹参茎叶酚酸和黄酮有效部位定量分析基于HPLC技术测定丹参茎叶酚酸和黄酮有效部位中酚酸和黄酮类物质的含量结果显示,不同产地的丹参茎叶酚酸和黄酮有效部位的酚酸和黄酮类成分含量差异较大,将丹酚酸B和迷迭香酸、芦丁作为指标成分,确定丹参茎叶酚酸和黄酮有效部位的含量限度。限定丹参茎叶酚酸和黄酮有效部位按干燥品算,含丹酚酸B、迷迭香酸的总量不得低于34.3%,芦丁含量不得低于1.1%。4.丹参茎叶酚酸和黄酮有效部位质量标准研究(草案)在药典基础上,对丹参茎叶酚酸和黄酮有效部位的水分、炽灼残渣进行检查,确立了丹参茎叶酚酸和黄酮有效部位的质量标准草案,为工厂生产工艺、质检等提供科学依据,保障有效部位质量的稳定可控。四、丹参茎叶酚酸和黄酮有效部位改善微循环障碍功效评价与作用机制研究1.丹参茎叶酚酸和黄酮有效部位改善微循环效应评价(1)丹参茎叶对微循环障碍大鼠的改善作用本实验基于尾静脉注射高分子右旋糖苷造模的微循环障碍大鼠进行研究,连续7天造模同时给药丹参茎叶酚酸部位与酚酸和黄酮部位。收集大鼠的全血、血浆、尿液、粪便、肺、胸腺、脑和心脏组织,分析大鼠的血液流变学指标、凝血功能指标、生化指标及微血管密度(MVD),评价丹参茎叶有效部位对微循环障碍大鼠的保护作用。结果表明,造模后,模型组的WBV、PV、ESR、HCT、FIB指标显著升高,APTT、TT、PT明显缩短,TXA2,ET-1,iNOS,P-selectin,VEGF,TNF-α 和 IL-1β的表达水平和 TXA2/6-keto-PGF1α数值升高,6-keto-PGF1α的表达水平明显降低,肺、胸腺和脑的MVD显著降低,心脏的MVD有明显降低趋势。丹参茎叶酚酸与酚酸和黄酮部位高、低剂量组均能显著改善微循环障碍大鼠血液流变学和凝血指标,并能不同程度回调ET-1、iNOS、VEGF、P-Selectin、TXA2、6-keto-PGF1α、TNF-α、IL-1β对照组的表达。丹参茎叶酚酸与酚酸和黄酮部位上调了微循环障碍引起的肺、胸腺、脑和心脏的微血管密度(MVD)的降低。其中,丹参茎叶酚酸和黄酮部位低剂量的保护效果较其他给药组和阳性药更优。表明丹参茎叶有效部位通过改善血流循环、抑制凝血、维护血管内皮功能、抑制炎症反应、维持血管稳态、保证组织的氧气和营养供应以改善微循环障碍。(2)微循环障碍大鼠的代谢组学研究与丹参茎叶的干预作用应用UPLC-QTOF/MS技术,对微循环障碍大鼠的血浆与尿液应用代谢组学研究,探讨微循环障碍对代谢物的影响及丹参茎叶酚酸与酚酸和黄酮有效部位干预后的作用机制。根据血浆和尿液代谢组学数据,鉴定出20种潜在的生物标志物,包括血液中8种、尿液中12种标志物。这些生物标志物主要与亚油酸代谢、谷胱甘肽代谢、泛酸和CoA生物合成、戊糖和葡萄糖酸相互转化、丙酮酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、β-丙氨酸代谢和TCA循环有关。丹参茎叶酚酸与酚酸和黄酮部位给药组与模型组可明显区分,呈现向正常组靠拢的趋势,代谢产物的相对表达也有所回调。将代谢组学与生物效应作相关分析后发现,丹参茎叶有效部位对代谢产物的调节作用也同时改善了相应的生化指标。研究表明,丹参茎叶酚酸、酚酸和黄酮部位均具有良好的微循环障碍保护作用,通过改善能量代谢、氧化应激、减少炎症因子释放实现,为揭示丹参茎叶有效部位的作用机制提供了科学依据。(3)微循环障碍大鼠的肠道菌群研究与丹参茎叶的干预作用应用16SrDNA技术对微循环障碍大鼠及丹参茎叶酚酸与酚酸和黄酮部位干预后的肠道菌群结构和多样性研究。LEfSe分析结果表明,微循环障碍大鼠粪便中菌群自门水平到属水平均存在差异菌属,属水平上发现12个差异菌属,其中丹参茎叶有效部位干预后,可改善模型引起的Akkermansia、关节假丝酵母菌属、红蝽杆菌科、韦荣球菌科、毛螺旋菌属的相对丰度升高,表明丹参茎叶通过减少肠道炎症、维护肠屏障正常运作以改善微循环障碍,揭示了丹参茎叶有效部位通过调节肠道菌群失衡而发挥治疗作用。2.丹参茎叶酚酸和黄酮有效部位在大鼠体内的药物代谢动力学研究基于正常和微循环障碍大鼠,应用UPLC-TQ/MS方法建立测定大鼠血浆中7种效应成分的测定方法。经方法学验证,该方法专属性好,线性关系良好,日内与日间精密度、准确度均在标准范围内,提取回收率、基质效应、稳定性均符合标准。研究结果显示,在正常大鼠中,丹参茎叶酚酸与酚酸和黄酮部位的药代动力学参数存在差异,提示黄酮类成分的存在可影响酚酸类成分的体内代谢过程。与正常大鼠比较,酚酸类成分在模型组中的药代动力学参数产生明显差异,主要有效成分的AUC0-t、AUC0-∞、Tmax、Cmax均不同程度增大,CLz/F呈现降低趋势,表明微循环障碍可能延缓药物代谢和消除,增加吸收入血,延长作用时间,从而使药效成分更好的发挥保护作用。本研究对丹参茎叶酚酸、酚酸和黄酮有效部位的体内效应物质与作用机制的阐释提供了参考。