第一部分同种异体肌腱移植膝关节交叉韧带重建的动物实验研究背景同种异体肌腱移植重建膝关节交叉韧带是近十年来的热门课题,国内外有一定数量的临床论文发表。应用同种异体肌腱重建膝关节交叉韧带,因不需要从患者取自体肌腱而造成取腱的损害,而受到学术界的关注。不同于取自体肌腱的现取现用,异体肌腱是在特定条件下保存了一定时间的植入材料,故对其临床应用需要动物实验的研究基础。有关的动物实验论文较少,国内尚无动物实验研究报告发表。同种异体肌腱移植重建膝关节交叉韧带,有以下几点备受关注:(1)同种异体肌腱的生物力学强度,经过冰冻和冷藏后其生物学强度是否有所损失,能否达到临床手术的需要。在制备和解冻异体肌腱过程中,哪些环节可能会导致胶原纤维崩解而影响肌腱的生物学强度,如何有效地保护肌腱。(2)同种异体肌腱植入体内后是否存在免疫排斥反应,引发手术后的关节渗液、发热、甚至感染等毒副作用。(3)同种异体肌腱移植后其愈合修复过程与自体肌腱移植有无差异。开展同种异体肌腱移植重建膝关节交叉韧带的动物实验研究,是建立人类同种异体肌腱库的前期基础工作,其结果和数据对于调整和改进同种异体肌腱的制备技术,对于应用同种异体肌腱重建膝关节交叉韧带临床治疗过程中正确掌握肌腱保存、运输、溶冻等重要环节技术,提供重要的实验数据和理论依据。同时,肌腱愈合过程的研究是制定临床治疗过程中的手术方案、康复方案的重要参考。动物实验研究是系统开发和研究人类同种异体肌腱库必不可少的工作。目的1、观察同种异体肌腱制备环节对肌腱的生物力学强度、组织形态学的影响,研究制备同种异体肌腱的工艺程序。2、观察同种异体肌腱植入动物体内后机体的免疫学变化。3、研究同种异肌腱重建交叉韧带后的组织愈合过程,通过与自体肌腱移植比较,探讨用同种异体肌腱替代自体肌腱重建膝关节交叉韧带的理论基础。方法1、手术模型用新西兰大白兔1/2BPTB移植,切开重建膝关节前交叉韧带。2、移植肌腱的制备方法无菌切取1/2BPTB,先经无菌生理盐水漂洗2～3次,然后在保护液(10%小牛血清+MEM溶液)中浸泡10～15分钟,以湿纱布拭去表面多余的水分,再放入冻存管中。-80℃深低温冷冻方法:先将冻存管置于4℃中平衡半小时,再置于-20℃冰箱中4小时,最后置于可控深低温冰箱中逐步降温至-80℃保存。程序冷冻液氮保存方法:将冻存管放入程序冷冻仪(CBS2100,USA)中,按设定好的冷冻程序先以1℃/min的速度降至4℃,平衡0.5h,再以0.5℃/min的速度降至-80℃,然后以1℃/min的速度降至-180℃,最后置于液氮储存罐中保存。移植肌腱的解冻方法:将取出的异体腱置于40℃生理盐水中融化15分钟,当肌腱恢复弹性后,再置于庆大霉素溶液(4万U/100ml)漂洗5～10分钟,再经生理盐水漂洗后即可使用。3、不同冻存方法对髌腱移植物的影响实验取12只大白兔双侧膝关节1/2骨-髌腱-骨复合体(BPTB)共48条,将所取BPTB再随机分为3组,即-80℃深低温保存2周组、程序冷冻液氮保存2周组和新鲜未冷冻组,各组随机选取8条BPTB行生物力学测试,6条行细胞活性检验,2条行形态学观察。4、移植实验用1/2BPTB同种异体肌腱的制备取16只大白兔1/2BPTB共64条,分别经-80℃深低温保存2周和程序冷冻液氮保存2周备异体移植用。5、BPTB移植重建膝关节交叉韧带实验48只大白兔随机分为3组,即-80℃深低温保存异体移植组、程序冷冻液氮保存异体移植组和自体移植组(对照组)。分别于移植后3周和8周观察淋巴细胞毒性、细胞活性、移植物强度和组织形态学变化。结果1、自体肌腱移植和两种冻存方法处理的异体肌腱移植后都会经历大致相似的组织学变化过程,初期大量新生成纤维细胞及毛细血管增生并侵入移植腱,移植腱的胶原组织逐渐坏死并被新生的胶原所替代,其修复随时间的推移而趋向成熟,最终演变为排列整齐呈波浪型的胶原纤维束。2、经-80℃和液氮两种深低温保存方法处理后,髌腱的最大载荷无明显下降,细胞活性均得到了较好的保存,程序冷冻液氮保存组更优。3、移植后的全过程均未表现明显的排斥反应,且免疫反应随时间的推移而下降。4、移植后3周,程序冷冻液氮保存组和-80℃深低温保存组相比最大载荷无差异,细胞活性较优,术后8周,程序冷冻液氮保存组移植物的最大载荷和细胞活性均优于-80℃深低温保存组。结论1、-80℃深低温保存法和程序冷冻液氮保存法均可有效地用于保存同种异体腱,而程序冷冻液氮保存法更优。2、-80℃深低温保存法和程序冷冻液氮保存法处理的同种异体腱移植术后无明显淋巴细胞素作用,需要在人体内进一步验证有无排斥反应或关节刺激反应。3、同种异体肌腱移植重建膝关节交叉韧带后其韧带愈合过程接近于自体肌腱,但较自体肌腱慢。第二部分同种异体肌腱移植关节镜下膝关节交叉韧带重建的临床观察背景膝关节是人体最大和最重要的下肢承重和运动关节,在运动过程中所产生的应力和剪力,大部分被膝部肌肉收缩所产生的力量所吸收,部分由关节韧带、关节纤维囊等静力稳定结构吸收。在运动过程中,膝关节遭受巨大外力,超过动力稳定的代偿能力时,韧带将承受超极限的负荷而发生撕裂和损伤。而韧带损伤后,静力和动力结构和功能失去平衡,导致膝关节运动时的不稳定。交叉韧带损伤是一种常见的膝关节损伤,是引起膝关节不稳的重要因素之一,交叉韧带损伤可导致关节疼痛及关节不稳,后期常引起关节松弛、关节退行性改变以及继发的半月板损伤和关节软骨破坏,严重者可导致关节病废。交叉韧带损伤常见于运动伤和交通事故伤,随着现代竞技体育的发展和高速车辆交通事故的增多,膝关节交叉韧带的损伤也逐渐增加,其损伤后的治疗成为骨科医生及运动医学专家关注的重要问题。对于因交叉韧带实质部的损伤引起的膝关节不稳定,用肌腱替代物植入重建膝关节的韧带结构和功能是临床上十分有效的治疗方法,关节镜微创技术的应用使膝关节交叉韧带重建手术创伤小、治疗效果好,从而得到广泛的医患认可。自体肌腱移植最早用于交叉韧带重建手术,常用的移植肌腱是中1/3髌腱带骨块(Bone-Patellar tengdon-Bone,BPTB)和腘绳肌腱(Semitendinosus+Gracilis,ST+Gr)。BPTB切取后约有20-40%的患者发生膝前区疼痛、弹响、跪地困难等膝前区症状,采用改良式双横切口技术仍有约10%的膝前区症状。切取ST+Gr后则损失屈膝肌力约20%,持续1年-1年半后始可恢复。采用自体肌腱移植存在不同程度地对患膝造成新的损害,特别是在多韧带损伤时,自体肌腱的取材受到较大的限制。同种异体肌腱移植重建膝关节交叉韧带手术后,经历与自体肌腱相似的韧带修复过程,可以用于替代自体肌腱以避免取自体肌腱时对已受伤的膝关节造成新的创伤,并且其选材不受限制,能满足严重的多韧带损伤的重建材料需要。但同种异体肌腱不同于自体材料的现取现用,而是经过了体外的冰冻、保存、解冻等多个环节,其植入人体安全性和临床治疗结果需要观察和总结。开展同种异体肌腱移植重建膝关节交叉韧带的临床治疗工作,需要高质量符合手术植入标准的肌腱供应来源。尽管国外现已形成具有一定规模的同种异体肌腱库,但由于准入制度等原因目前阶段尚无法向我国提供产品,亦无法向我国提供标准化的同种异体肌腱制备程序。本课题总结国外的相关资料和经验,结合动物实验所得到的数据,研究建立人类同种异体肌腱库的技术和方法,并制定了供体选择、取材、包装、冷冻、解冻等相关的工艺流程以及管理制度。同种异体肌腱可提供不同于自体肌腱的移植材料,如1/2BPTB(自体为1/3髌腱)、1/2股四头肌腱(自体为1/3股四头肌腱),而胫骨前后肌腱、腓骨长短肌腱及跟腱则是无法从自体割取的。移植材料不同,其手术方法亦存在差异。本课题尚对前后交叉韧带重建的手术方法进行探索。目的1、研究和改进建立人类同种异体肌腱制作的技术方法和操作规程,建立腱库管理的相关制度,为本课题临床膝关节交叉韧带重建手术提供符合要求的同种异体肌腱。2、根据同种异体肌腱的特点,探讨特定的关节镜下重建手术方式。3、通过临床应用,观察同种异体肌腱植入人体的安全性,通过临床随访分析,总结同种异体肌腱移植重建膝关节前年交叉韧带临床治疗效果。方法1、同种异体肌腱库的建立(1)供体选择健康捐献者及创伤截肢术后的肢体。(2)供体筛选①年龄供者年龄原则上无严格限制,本课题所选供体均为20～45岁男性。②排除全身的急慢性感染、血液传播性疾病、恶性肿瘤特别是骨骼肌肉系统肿瘤等。③血样检查包括HIVAb)、乙肝病毒检测、丙肝病毒(HCV)抗体检测、梅毒快速血浆反应素试验(RPR)、血液细菌培养等。(3)取材在离体或死亡后2小时内取材为最佳,特殊情况可延长到12小时。在手术台无菌条件下取腱,经无菌生理盐水漂洗2-3次后,浸泡在保护液(10%小牛血清+MEM溶液)中10～15分钟,三层无菌塑料封装袋中。(4)冷冻用程序冷冻仪逐步降温到-180℃,然后置于液氮罐中(-196℃)保存,10天后即可使用。(5)腱库管理①标签和说明移植材料制备后,依据其组织来源、部位、制备方法、灭菌方法等,正确地冠以名称,标明材料的编号、大小、体积、数量,标明制备时间和使用的有效期限,并标明注意事项和贮存条件,开启方法和使用方法。②建立各种记录制度严格建立各种操作记录制度,包括供体的筛选、组织获取、材料制备、发放等各种操作过程的记录。③专人监控复核发放登记。2、经关节镜膝关节前交叉韧带重建治疗组(1)应用1/2BPTB移植单束重建ACL 27例、应用胫骨前后肌腱及腓骨长短肌腱双束重建ACL 15例。全部采用关节镜微创技术按照等长点的原则进行重建,BPTB两端骨块均用钛钉或可吸收界面镙钉固定,双束重建股骨骨道端用内置钢板固定,胫骨骨道端用可吸收界面镙钉固定。(2)术后按照统一的康复程序进行功能训练。(3)疗效果观察指标膝关节伸屈活动幅度,与术前相同的Lysholm评分、Lachman试验、轴移试验、前抽屉试验以及患者主观评价。(4)观察伤口愈合情况、关节肿胀或积液情况、有无感染发生等。3、经关节镜膝关节后交叉韧带重建治疗组(1)应用跟腱双束重建后交叉韧带21例,全部采用关节镜微创技术按照等长点的原则进行重建,胫骨骨道移植腱骨块用钛钉或可吸收界面镙钉固定,股骨骨道用可吸收界面镙钉固定。(2)术后按照统一的康复程序进行功能训练。(3)疗效果观察指标膝关节伸屈活动幅度,与术前相同的Larson评分、Lysholm评分、Lachman试验、后抽屉试验以及患者主观评价。(4)观察伤口愈合情况、关节肿胀或积液情况、有无感染发生等。结果1、本组手术所用的肌腱,采用40℃盐水15分种解冻技术,所有肌腱外观色泽新鲜、骨块强度虽有降低但能达到内固定要求。术中对移植腱多点细菌培养均为阴性。2、本组所有手术无一例发生切口或关节腔感染,部分病例早期有轻度到中度的关节肿胀或积液,一般经过1～3个月可消退。3、前交叉韧带重建的42个膝关节中,有37例得到随访,平均随访时间1年2个月(6个月～2年3个月)。随访指标包括与术前相同的Lysholm评分、Lachman试验及前抽屉试验以及患者主观评价。末次随访结果:Lysholm评分由术前(58.2±6.3)分提高至术后(92.1±4.8)分。所有患者的膝关节活动范围基本恢复到与对侧相同。患者自我评价,满意25个膝,比较满意10个膝,尚可2个膝。无一例接受二次修正手术。4、后交叉韧带双束重建的21个膝关节中,有18膝得到随访,平均随访11个月(6个月～1年9个月)。随访指标包括与术前相同的Larson评分、Lysholm评分、反向Lachman试验及后抽屉试验物理检查以及患者主观评价。末次随访结果:Larson评分法功能评估术前平均59(37～72)分,术后平均92(85～98)分,Lysholm评分法功能评估术前平均56(39～76)分,术后平均91(81～99)分。Larson评分平均提高33分,Lysholm评分平均提高35分。所有患膝术前后抽屉试验(PDT)及反向Lachman试验均阳性,术后仅2例后抽屉试验弱阳性,1例反向Lachman试验弱阳性。患者自我评价,满意11例,比较满意6例,尚可1例。结论1、本腱库所制备同种异体肌腱安全、可靠,经临床应用验证,无细菌污染,植入体内后无明显刺激及炎症反应。2、同种异体肌腱移植经关节镜膝关节前后交叉韧带重建技术,创伤小、治疗效果好,对因交叉韧带损伤引起的关节不稳定有显著的临床治疗效果。