刚地弓形虫是一种细胞内寄生原虫,能感染包括人类在内的几乎所有温血动物。感染后可引起弓形虫病,为一种严重的人兽共患寄生虫病,全世界约有1/3的人口感染该病。孕妇感染后易引发死产、流产等症状,免疫力低下患者感染弓形虫病后易引起严重疾病,甚至危害生命,弓形虫病对畜牧业也有一定的危害。寄生虫组织蛋白酶参与从宿主细胞获取营养物质、感染宿主细胞、以及参与寄生虫逃避宿主细胞的免疫反应等过程。弓形虫组织蛋白酶作为一种潜在的诊断药物和疫苗候选因子已被广泛研究,弓形虫组织蛋白酶B (TgCPB)在弓形虫入侵宿主细胞及在其内增殖的过程中起到了关键的作用,本论文以基因敲除技术为基础,来研究TgCPB基因的部分生物学特性,以此为弓形虫病的防治提供依据。重组质粒的构建利用PCR扩增技术,从弓形虫基因组上扩增TgCPB基因5’非编码区(CPB5’-UTR/1709bp)和3’非编码区(CPB3’-UTR/1810bp),将其分别克隆入载体质粒pBluescript中,将phle基因也克隆入pBluescript中,构建5’UTR-T-pBluescript-3’UTR-phle转染质粒。酶切鉴定结果表明成功构建了5’UTR-T-pBluescript-3’UTR-phle质粒。经DNA测序分析,与Genebank上刊登的弓形虫基因组序列的同源性为100%。弓形虫TgCPB缺失株的筛选及鉴定NotI酶切线性化重组质粒,得到条带为8088bp的线性质粒,电穿孔转染入弓形虫体内,同源重组整合入弓形虫基因组中,阳性克隆因含有抗性基因而能在抗性筛选培养基中生长,未整合的虫体及阴性对照则死亡,经抗性筛选1月左右,获得弓形虫TgCPB缺失株。经PCR鉴定,缺失株成功扩增出前后臂分别为2134bp和2552bp目的条带。根据缺失掉的3238bp基因组序列,设计Southern杂交探针引物,经过Southern-blotting鉴定,TgCPB缺失株无条带,GT1野生株有条带,两个实验均证明缺失株筛选成功。弓形虫TgCPB缺失株生物学特性的研究应用间接免疫荧光实验检测TgCPB缺失后弓形虫粘附、入侵宿主细胞的能力。粘附实验结果表明,缺失TgCPB基因后,弓形虫粘附宿主细胞的能力没有明显变化,表明该基因可能不直接参与弓形虫粘附宿主细胞的过程。入侵实验表明,缺失TgCPB基因后,虫体入侵宿主细胞的能力也没有明显改变。利用间接免疫荧光实验检测缺失TgCPB基因后,弓形虫在宿主细胞内的增殖情况,实验结果表明,缺失TgCPB基因后,弓形虫在宿主细胞内的增殖能力明显减弱。另外,利用荧光定量PCR的方法对虫体增殖情况进行检测,结果显示,缺失TgCPB基因后,弓形虫在细胞内的增殖速度显著减慢,与免疫荧光实验相符,提示该基因可能为弓形虫的一种新型毒力基因,可能参与弓形虫的致病机理。本实验还应用流式细胞术技术对缺失株及野生株进行细胞周期检测,结果显示GTl组S期百分数是35.13±1.84,CPB组是53.03±1.87。这表明,TgCPB缺失株组提前进入S期,且S期持续时间较长,说明缺失TgCPB基因后,TgCPB比GT1更早的进入了生长的平台期,降低了虫体在一定时间内生长量的积累,也可以说缺失TgCPB基因后不利于弓形虫的增殖,实验结果与荧光定量PCR结果相符。基于荧光定量PCR及流式细胞术实验结果,推测TgCPB基因可能为一种致病基因。实验中将弓形虫与巨噬细胞共培养,应用Griess法对细胞培养上清NO的含量进行检测,结果显示,缺失TgCPB基因后NO的表达量明显增高,利用生物软件进行分析,与GT1野生株组相比差异极显著,表明TgCPB基因可能在弓形虫介导的信号通路中起到关键的作用。另外,本论文还对TgCPB基因进行了虫体定位分析,根据ToxoDB中登陆的TgCPB编码区序列,设计并合成一对引物,利用原核表达实验,表达重组蛋白PET-22b-CPB-DE3。 SDS-PAGE及、Vestern-blotting实验均出现62.5kD的蛋白条带,表明成功获得重组蛋白且该蛋白具有一定的反应原性。经镍柱法纯化蛋白,免疫小鼠,制备多克隆血清,应用免疫荧光实验进行TgCPB蛋白的虫体定位分析,结果表明,TgCPB蛋白定位于弓形虫虫体两端或表面。该实验成功获得TgCPB缺失载体及单克隆虫株,通过对其部分生物学特性的研究发现,TgCPB基因的缺失对其正常的生命活动产生了重要的影响,为弓形虫病的防治提供依据。