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1.目的阳春砂Amomum villosum Lour.的干燥成熟果实称为砂仁,是广东的道地药材之一,具有温脾止泻、化湿开胃、理气安胎的功效。本课题组前期已经对不同成熟时期和经过茉莉酸甲酯诱导的阳春砂进行了转录组测序,并筛选出了多个预测与阳春砂挥发性萜类合成相关的萜类合酶和转录因子基因,本论文对已克隆的单萜合酶基因AvTPS1和AvTPS3进行功能鉴定,并对两个转录因子AvMYC2、AvMYC4b基因进行克隆、蛋白纯化及原核表达,以进一步认识阳春砂的萜类次生代谢途径中的关键基因。2.方法2.1 AvTPS1、AvTPS3的功能鉴定2.1.1蛋白原核表达及酶促反应以课题组前期克隆的AvTPS1和AvTPS3为基础,利用In-fusion反应将去除转运肽的编码区构建到带双His标签的原核表达载体pET32a上,利用大肠杆菌Rosetta表达菌株进行原核表达,利用Ni-NTA柱纯化重组蛋白AvTPS1和AvTPS3,进行酶促反应并利用GC-MS进行产物检测。2.1.2亚细胞定位利用In-fusoin反应将AvTPS1和AvTPS3的编码区构建到瞬时表达载体pAN580上,用酶解法分离获得烟草Nicotiana tabacum原生质体,通过PEG介导法将重组载体转化烟草原生质体,利用激光共聚焦显微镜观察AvTPS1和AvTPS3在植物细胞内的定位。2.1.3实时荧光定量PCR和阳春砂挥发性萜类的测定以阳春砂45 DAF(Days After Flower)和75 DAF的果实(分为果皮和种子团)以及叶、根、匍匐茎为材料,分别提取阳春砂总RNA并反转录,利用实时荧光定量PCR法测定基因相对表达量;用超声提取法和GC-MS测定阳春砂上述组织部位的挥发性萜类含量。对AvTPS1和AvTPS3在阳春砂不同组织部位的基因相对表达量与相关的挥发性单萜含量进行分析。2.1.4启动子的克隆及活性分析从阳春砂叶片基因组DNA(gDNA)中克隆AvTPS1、AvTPS3基因,再根据AvTPS1和AvTPS3 gDNA序列设计引物,通过FPNI-PCR的方法从阳春砂叶片gDNA中克隆启动子并进行序列分析,构建由该启动子驱动GUS基因的重组表达载体pCAMBIA-AvTPS1p,转化农杆菌。利用农杆菌介导法侵染烟草Nicotiana benthamiana叶片,进行瞬时表达验证AvTPS1启动子的活性。2.2转录因子AvMYC2、AvMYC4b的克隆及原核表达以转录组中AvMYC2(Unigene0136713)和AvMYC4b(Unigene0074125)为目标基因分别通过普通PCR和RACE进行克隆。再利用In-fusion构建表达载体pMAL-C5X-AvMYC2及pET32a-AvMYC4b,并将其转化进Rosetta菌株进行蛋白表达,分别利用MBP标签和Ni-NTA柱进行蛋白纯化。3.结果3.1阳春砂单萜合酶AvPS和AvBPPS的功能鉴定3.1.1 AvTPS1和AvTPS3的体外蛋白功能通过原核表达和分离纯化,获得AvTPS1和AvTPS3重组蛋白。经过体外酶活鉴定,AvTPS1催化GPP底物生成α-蒎烯(36.69%)和β-蒎烯(63.31%),将其命名为蒎烯合酶(pinene synthase,AvPS)。重组蛋白AvTPS3以GPP为底物,产物经过碱性磷酸酶处理后,通过GC-MS检测到龙脑基二磷酸脱磷酸后的产物龙脑(65.91%),以及莰烯(17.31%)、β-月桂烯(3.63%)和柠檬烯(13.14%),因此,按其主产物将AvTPS3命名为龙脑基二磷酸合酶(bornyl diphosphate synthase,AvBPPS)。3.1.2 AvPS和AvBPPS的亚细胞定位通过亚细胞定位实验,发现AvPS和AvBPPS均定位于叶绿体,符合生物信息学的预测和单萜合酶定位于质体的特点。3.1.3 AvPS和AvBPPS在阳春砂不同组织中的表达量与相关挥发性萜类的分析实时荧光定量PCR结果显示AvPS主要在果皮中表达,特别是在45 DAF的果皮中高表达,其他组织有少量表达,而在种子团中不表达。AvBPPS在种子团中高表达,特别是在45 DAF的种子团中显著高表达,而在其他组织的表达水平较低。挥发性萜类测定的结果表明阳春砂含有丰富的挥发性萜类,特别是单萜。总共检测到15种单萜化合物、9种倍半萜化合物,其中乙酸龙脑酯在药用部位种子团中显著富集(占总单萜相对含量(29)50%)。果皮、根、匍匐茎和叶中均检测到α-蒎烯和β-蒎烯,与AvPS的表达相符,因此推测AvPS参与阳春砂果皮、根、匍匐茎和叶中蒎烯的合成。由于蒎烯是与生物防御相关的萜类化合物,结合AvPS在果皮中的高表达和蒎烯在果皮中的高含量,推测AvPS可能参与阳春砂的生物防御。由于AvBPPS的主产物龙脑基二磷酸是龙脑、樟脑和乙酸龙脑酯的关键前体,本文分析了阳春砂挥发性萜类中与AvBPPS直接和间接相关的6种挥发性萜类(莰烯、柠檬烯、β-月桂烯和龙脑、樟脑、乙酸龙脑酯),发现AvBPPS在种子团中的高表达与这6种挥发性萜类,特别是乙酸龙脑酯,在种子团中的富集相关,推测AvBPPS是阳春砂主要药效物质乙酸龙脑酯下游生物合成途径的关键酶。3.1.4阳春砂AvPS和AvBPPS gDNA的克隆以及AvPS启动子的克隆和鉴定获得了AvPS和AvBPPS的gDNA,序列长度分别为2 444 bp和2 374 bp,经过序列比对发现它们均含有7个外显子和6个内含子。通过FPNI-PCR获得568 bp的AvPS启动子序列,其含有10种顺式作用元件,包括启动子保守元件TATA-box和CAAT-box以及可被转录因子MYC结合的G-box,推测AvPS受MYC类转录因子的调控。瞬时表达结果证明AvPS启动子启动了GUS基因的表达,具有启动子的功能。3.2阳春砂转录因子AvMYC2、AvMYC4b的克隆与原核表达克隆获得阳春砂MYC转录因子AvMYC2和AvMYC4b。AvMYC2的cDNA序列全长2 075 bp,包含171 bp的5’UTR,1644 bp的ORF和260 bp的3’UTR,编码547个氨基酸,预测蛋白大小为59 kDa。AvMYC4b全长2 579 bp,包含195bp的5’UTR,1 995 bp的ORF和389 bp的3’UTR,编码664个氨基酸,预测蛋白大小为72 kDa。经过生物信息学分析,AvMYC2、AvMYC4b氨基酸序列与其他植物的MYC相似,含有转录因子MYC家族的保守结构域,预测可定位于细胞核中。成功构建重组表达载体pMAL-C5X-AvMYC2及pET32a-AvMYC4b,并转化大肠杆菌Rosetta(DE3)细胞,经过诱导表达与纯化,获得重组蛋白,与预测蛋白大小一致。4.结论本文鉴定了单萜合酶AvPS和AvBPPS的功能,AvPS生成α-蒎烯和β-蒎烯;AvBPPS以龙脑基二磷酸为主产物,以莰烯、β-月桂烯、柠檬烯为次要产物。AvPS和AvBPPS均定位于叶绿体中。AvBPPS参与乙酸龙脑酯、龙脑、樟脑、莰烯、β-月桂烯、柠檬烯的生物合成途径,是阳春砂主要药效物质乙酸龙脑酯生物合成途径的关键酶。AvPS参与阳春砂中α-蒎烯和β-蒎烯合成,根据AvPS的启动子含有G-box推测其可能受MYC转录因子的调控。另一方面,从阳春砂中克隆得到转录因子AvMYC2、AvMYC4b,并获得了相应的纯化蛋白,为其后续的生物功能鉴定及AvPS的转录调控研究奠定了基础。