实验背景和研究目的 心肌梗死的直接后果是心肌坏死。由于残存的心肌细胞无法重建坏死组织，一般情况下梗死后心脏的功能进行性恶化。尽管心脏移植是晚期心脏疾病理想的治疗手段，但是供体匮乏等原因使得这一技术难以普及。于是人们积极探索其他可能的治疗手段。自体细胞移植是一种很有希望的生物疗法。骨髓间充质细胞(MSCs)具有保持未分化特性无限增殖的能力，并且能够分化为包括心肌细胞在内的各种类型的细胞。与其他类型用于移植的细胞相比，MSCs能够从成年人自身获得，因而不会引起伦理学问题或组织排斥反应。目前，自体MSCs心肌内移植已经成为恢复心肌梗死后组织活力潜在的治疗手段。 本研究旨在探讨心肌梗死后自体MSCs心肌内移植引起心肌再生并 第四军医大学博士学位论文.....甲..........减轻心功能不全的可能性，同时明确体外诱导及注射部位等因素对移植效果的影响，另外进行一系列的体外实验旨在评价MSCs用于心肌梗死后心肌内移植治疗的潜在价值。 方法和结果 体外部分密度梯度离心法分离Mscs，体外贴壁培养扩增。流式细胞仪分析表明此种方法培养的MSCs表面抗原CD34表达阴性，CD44表达阳性的细胞均在95%以上。MSCs在体外能够快速增殖大量扩增，在培养基中添加5一澳脱氧尿喻睫核昔酸仍rdU)孵育24h后，超过90%的MScs被BulU有效标记。通过不同浓度的5一氮杂胞昔(5一姗)诱导24h后，继续培养3w，免疫细胞化学、westem blot、透射电镜等手段均证实部分 MSCs已初步向肌细胞分化。通过将MSCs用BrdU标记后与乳鼠心肌细胞直接接触式共同培养，3w后大多数B川U标记胞核阳性的MScs免疫细胞化学染色呈现胞浆横纹肌a一actin阳性。透射电镜下可观察到共培养体系内退化的心肌细胞和向肌细胞分化的MSCs.但是在另一共培养体系内，与心肌细胞分层培养的MSCs并未表现出向肌细胞分化的趋势。另外，对培养的MScs采用脂质体包裹的方法转染重组质粒peDNA3.1一vEGF16，，免疫细胞化学染色及图像分析系统证实转染后的细胞VEGFI“的表达明显增加。 体内部分34只新西兰白兔均经过骨穿抽取骨髓，开胸建立心梗模型，MSCs体外培养及二次开胸心肌内注射等操作，按照对其MSCs的处理方式和心肌内注射的成分不同随机分为3组:A组12只，其MSCs未经体外诱导:B组12只，其MSCs经5-aza体外诱导;C组10只，其MSCs只进行体外实验研究。A、B两组注射自体细胞的悬液，C组列为对照组，注射生理盐水。根据注射位置不同进一步将A、B两组细分为A~和Am，n，Bscar和B~。两个亚组(每个亚组各6只实验动物)。纳入第四军医大学博士学位论文分组的对象排除了建模、骨穿、细胞培养、心肌内注射等任一环节失败的实验动物。建立兔的急性心肌梗死模型，同时穿刺抽取骨髓分离培养Zw左右。移植前MSCs培养墓中添加BrdU孵育24h。随后二次开胸心肌内注射细胞或生理盐水。建立梗死前、开胸注射前和注射后lmon超声检测左心室(LV)功能。注射后lmon取心脏组织行光镜及电镜检查。与C组相比，心肌内注射细胞后lmon时A、B两组LV功能显著改善。A、B两组之间无显著性差异。亚组分析表明细胞注射的部位是造成心梗后LV功能差异的原因。最后组织学检查证实各组梗死区组织学特点无明显差异，为疤痕组织增生的典型表现。BrdU标记阳性的细胞分布范围与细胞注射范围基本一致。其中，介于正常心肌和梗死心肌之间的“边缘区”可见以BrdU标记阳性的肌细胞为特点的心肌再生，透射电镜下可见梗死边缘区变性的心肌细胞和向肌细胞分化的MSCs。 结论 MSCs易于分离、纯化和大量扩增，采用BrdU标记简便高效。体外采用5一aza诱导或与心肌细胞直接接触共同培养，均有部分MSCs向肌细胞分化。采用脂质体包裹重组质粒PcDNA3.1一vEGFI65可成功转染Mscs，转染后MSCs的VEGF表达一过性增高.体内研究表明，与未诱导的MSCs相比，5一aza诱导的MSCs移植并未表现出更多的优越性。MSCs注射的部位是心功能改善关键的影响因素。如果注射到疤痕区，MSCs更倾向于分化为成纤维细胞。如果注射到边缘区，MSCs则在存活心肌细胞的直接接触下倾向于分化为肌细胞.这与前述体外共培养实验得出的结论相同，即MSCs向心肌细胞转化需要与心肌细胞的直接接触。因此，在进行MSCs心肌内移植时不仅要强调将MSCs投送到梗死区，更要注意将MSCs投送到尚有存活心肌的边缘区。