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小G蛋白是指分子量20~30KD的单亚基G蛋白，已发现有100多种成员。根据其一级结构的同源性及功能将它们分为Ras,Rho,Rab,Arf,sar1和Ran六个家族，具有复杂且重要的生物学功能。Rho即Ras相似物（Ras homologue），Rho家族在细胞骨架重组和转录调节中发挥重要作用，而且近年来研究还发现Rho家族参与多种肿瘤的发生发展过程。而国内尚未见Rho蛋白与肿瘤发生、发展间关系这方面的研究报道。因此，我们以大肠癌组织和细胞株为研究对象，研究Rho家族是否参与大肠癌发生发展过程及其可能的作用机制。第一部分 RhoA基因在大肠癌组织中的表达首先我们研究了RhoA基因mRNA在大肠癌组织中的表达。建立测定大肠癌组织RhoA基因mRNA表达的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)最适条件，在半定量水平测定42例大肠癌手术标本正常粘膜组织和大肠癌组织的RhoA基因mRNA表达的相对水平，并探讨与临床病理学指标的关系。结果发现42例大肠癌组织中RhoA基因表达较相应正常粘膜组织表达高，配对t检验分析有非常显著意义(P<0.01)。以42例肿瘤与正常粘膜表达量的比值平均值2.02为界，将患者分为过度表达组和高表达组, 过度表达组中淋巴结转移发生率较高, 肿瘤分期较晚（P<0.05），在淋巴结转移数方面两组之间差异有非常显著意义（P<0.01）。同时采用了PCR-SSCP的方法检测RhoA基因中结构改变可能影响RhoA功能的片段，结果在检测的42例大肠癌组织中均未发现异常泳动条带，提示大肠癌组织中无RhoA基因突变。研究结果提示RhoA表达增加，而非基因突变在大肠癌发生发展中发生作用。第二部分 构建稳定转染RhoA-DN的人大肠癌细胞株LoVo-DN显性失活突变体RhoA（T19N）（下文简称RhoA-DN ,Dominant negative）是第<WP=8>19位氨基酸从苏氨酸突变为天冬酰胺的RhoA蛋白，这种蛋白能影响野生型RhoA和鸟苷酸交换因子(GEF)发生作用，从而抑制细胞中野生型RhoA功能。为了在细胞水平进一步探讨RhoA基因在人大肠癌发生发展中的可能作用及其机制，我们将RhoA-DN 稳定转染至人大肠癌细胞株LoVo，以研究RhoA蛋白的功能。首先将编码RhoA-DN 和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的序列插入真核表达载体pcDNA3构建pcDNA3-RhoA-DN载体。经酶切及测序鉴定后用脂质体转染技术将pcDNA3-RhoA-DN载体转染至人大肠癌细胞株LoVo，然后用G418筛选稳定转染的细胞株并命名为LoVo-DN。此外，将pcDNA3空载体转染至人大肠癌细胞株LoVo并筛选稳定转染的细胞株并命名为LoVo-PC，以作为空白对照。进一步研究发现LoVo-DN中有外源性的突变体RhoA-DN mRNA表达。而且，LoVo-DN细胞株在荧光显微镜下可见到绿色荧光，表明我们已经成功构建了稳定转染有RhoA-DN突变体的人大肠癌细胞株LoVo-DN。第三部分 抑制RhoA蛋白活性对人大肠癌细胞株LoVo生物活性的影响及其机制的初步研究在实验中可观察到稳定转染RhoA-DN 抑制细胞内源性RhoA蛋白活性后，LoVo-DN细胞发生形态改变，由梭形或纺锤形变为多边形或圆形。同时发现细胞生长缓慢。因此进行细胞增殖实验并绘制生长曲线，发现LoVo-DN细胞的体外增殖速度较对照明显减慢。将LoVo、LoVo-PC和LoVo-DN肿瘤细胞接种T淋巴细胞缺陷型裸鼠，建立大肠癌动物模型，发现LoVo-DN细胞的体内增殖亦明显减慢（P<0.01）。通过流式细胞技术(FCM)分析细胞周期发现LoVo-DN细胞周期阻滞于G0/G1期（P<0.01）。提示抑制RhoA功能可使肿瘤细胞生长停滞于G0/G1期，抑制人大肠癌细胞株LoVo的体内体外增殖。而在成纤维细胞的研究发现Rho蛋白参与调节多种细胞周期相关蛋白，如cyclinD1，p21Cip1， p27kip1等。且有研究报道p21Cip1和大肠癌发生发展关系密切，因此我们选择免疫斑点技术(Western blot)对三种细胞中p21Cip1蛋白表达进行分析，发现LoVo-DN细胞中p21Cip1蛋白表达明显增加（P<0.01）。提示抑制RhoA功能使肿瘤细胞生长停滞于G0/G1期可能和p21Cip1表达上调有关。此外还通过细胞体外侵袭运动实验了解稳定转染RhoA-DN 是否影响LoVo细胞侵袭运动能力。细胞侵袭运动小室由上室和下室组成，两室由覆人工基底膜的薄膜<WP=9>隔开。在趋化因子作用下，穿膜细胞数表明细胞侵袭运动能力。结果发现穿膜的LoVo-DN细胞数较对照组明显减少，提示其侵袭能力减弱（P<0.01）。因细胞穿膜运动过程包括细胞变形运动和人工基底膜的降解，因此LoVo-DN细胞侵袭能力减弱，提示RhoA参与调节LoVo细胞运动或间质降解过程。小结：本研究发现大肠癌组织中RhoA基因表达较相应正常粘膜组织高，且RhoA基因表达和淋巴结转移，肿瘤分期相关。进一步研究发现抑制RhoA功能使大肠癌细胞株p21Cip1表达上调，使肿瘤细胞生长停滞于G0/G1期，从而抑制其体内体外增殖，并可能通过多种途径影响细胞侵袭能力。因此RhoA可能通过参与控制细胞增殖及运动，在大肠癌发生发展中发挥重要作用。抑制其功能可能为大肠癌治疗提供新的靶点。