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目的:用免疫活性细胞输注的过继性细胞免疫疗法(adoptive cell immunotherapy ACI)是肿瘤生物治疗的研究热点之一。此治疗方法不仅是常规手术、放疗、化疗等抗肿瘤治疗的补充,它对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病变等都有良好的效果。更为晚期不适于手术治疗或无法承受放、化疗所带来的副作用的患者开辟了一个新的治疗途径,成为人类抗肿瘤治疗最有希望的措施之一。细胞因子诱导的杀伤细胞CIK(cytokine induced killer,CIK),作为一种新型高效的免疫活性细胞因其具有增殖能力强、杀瘤谱广、杀瘤活性强等其它一些效应细胞无法比拟的优越特性,在过继性细胞免疫治疗中得到了广泛的应用。如何提高CIK细胞的数量、增强其抗肿瘤杀伤活性以及抗肿瘤特异性等方面是目前针对于CIK细胞的研究关键。树突状细胞(DC)是迄今为止发现的效力最强的抗原递呈细胞,具有高效摄取、加工、递呈肿瘤相关抗原,并激活初始免疫反应的独特功能。本实验利用DC细胞与CIK细胞共同培养,并且负载特异性抗原,以便获得数量更多、杀伤活性更高,更具有特异性的抗肿瘤效应细胞。但是在实际应用过程中,抗肿瘤效应细胞在肿瘤微环境中通常被诱导进入"免疫无能"(immune anergy)状态,因此不能有效地识别和杀伤肿瘤细胞。去除体内的免疫抑制细胞,充分发挥效应细胞的功能,对于提高肿瘤的治疗效果具有重要意义。CD4~+CD25~+Treg细胞是新发现的具有免疫抑制作用的细胞群,目前较为常用的是根据产生的途径不同将CD4~+CD25~+ T细胞分为自然产生的调节性T细胞(natural regulatory T cells nTreg)和诱导产生的调节性T细胞(induced regulatory T cells iTreg)两类。大量研究发现在胃癌、肺癌、乳腺癌等癌症患者的外周血、肿瘤浸润淋巴结中都可以检测出CD4~+CD25~+T细胞,CD4~+CD25~+T细胞可能通过识别肿瘤抗原,活化后发挥其免疫抑制作用,抑制机体抗肿瘤免疫应答的产生,使机体处于对肿瘤低应答或无应答的一种状态。这些研究说明CD4~+CD25~+Treg细胞对于肿瘤的免疫治疗是一个重要的障碍。因此寻找既能增强免疫效应细胞的抗肿瘤作用又能抑制或清除CD4~+CD25~+T细胞作用的方法,将为提高和改善肿瘤免疫治疗提供一个崭新的途径。本实验将特异性抗原致敏的成熟DC与CIK细胞共同培养,作为抗肿瘤免疫效应细胞,从形态学、对细胞增殖和凋亡的影响以及对肿瘤细胞杀伤活性等不同方面观察不同的阶段应用免疫磁珠分选去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原致敏的DC-CIK细胞对B16黑色素瘤动物模型的作用,来探讨和分析CIK细胞、Treg细胞在抗肿瘤免疫中所起的作用以及相互关系,来为抗肿瘤免疫治疗的临床应用提供更多的治疗思路和理论基础。方法:本实验以C57BL/6小鼠的黑色素瘤动物模型作为研究对象,制备黑色素瘤动物模型,并应用放射性钴60对小鼠黑色素瘤动物模型进行照射,使小鼠机体内形成非髓性淋巴细胞删除状态,使C57BL/6小鼠的黑色素瘤动物模型的免疫机制丧失。取小鼠外周血单个核细胞(PBMC)制备树突状细胞和CIK细胞,将两者共同培养,并且负载肿瘤特异性抗原,并检测其免疫表型。以免疫磁珠分选方法分别在培养前及培养后去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分。分别得到去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分再经体外诱导产生的特异性抗原负载的DC-CIK效应细胞、经体外诱导产生肿瘤特异性抗原负载的DC-CIK效应细胞,再用磁珠分选方法去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK效应细胞和未去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK效应细胞共三组抗肿瘤免疫效应细胞。然后再将制备好的达到非髓性淋巴细胞删除状态的C57BL/6小鼠的黑色素瘤动物模型随机分为4组。第一组:回输先通过磁珠分选去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分再经体外诱导产生的特异性抗原负载的DC-CIK效应细胞,第二组:回输先经体外诱导产生肿瘤特异性抗原负载的DC-CIK效应细胞,再用磁珠分选方法去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK效应细胞。第三组:回输未去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的DC-CIK细胞组。第四组:对照组。通过测量各组的肿瘤体积、重量、计算抑瘤率,比较其抑瘤作用,并应用透射电镜观察特异性抗原负载的DC-CIK细胞及杀伤肿瘤细胞的形态学表现。应用流氏细胞技术(FCM)检测各组肿瘤细胞的增殖周期中G0/G1期、S期、G2/M期细胞比率、细胞增殖指数(proliferation Index,PI)和细胞凋亡指数(apoptosis Index ,AI)的变化,观察特异性抗原负载的DC-CIK对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。采用MTT染色法检测培养前去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组、培养后去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组、未去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组三组抗肿瘤免疫效应细胞对B16黑色素瘤肿瘤细胞的杀伤效应。结果:采用特异性肿瘤抗原致敏的DC细胞与CIK细胞共同培养,分析其免疫表型,透射电镜观察特异性抗原负载的DC-CIK细胞体积增大,核有切迹,细胞质内细胞器丰富,粗面内质网扩张,细胞表面有突起,与肿瘤细胞密切接触,大量肿瘤细胞凋亡、坏死。培养前去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组肿瘤平均体积0.0377±0.0128cm3 ,培养后去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组肿瘤平均体积0.0359±0.0131cm3,未去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组肿瘤平均体积0.1278±0.0362 cm3,而对照组肿瘤平均体积0.4052±0.0429cm3。三组实验组肿瘤体积均明显小于对照组(P<0.05),不同阶段去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的两组之间比较,虽然培养前去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组较培养后去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分组体积略小,但没有显著性差异(P >0.05)。但两组与未去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组比较肿瘤体积有统计学差异(P<0.05)。三组特异性抗原致敏的DC-CIK效应细胞组抑瘤率明显高于对照组(P<0.05);去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分两组抑瘤率明显高于未去除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CIK效应细胞组(P<0.05),但两组之间没有明显差异(P >0.05)。瘤体重量对照组3.361±1.07g,培养前去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组0.958±0.32g,培养后去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组0.939±0.41g,未去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组1.651±0.57g。同样三实验组瘤体重量均明显小于对照组(P<0.05)。但不同阶段去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的两组肿瘤重量都小于未去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分组,并且有统计学差异(P<0.05)。不同阶段去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的两组之间则没有显著性差异(P >0.05)。透射电镜可以观察到特异性抗原负载的DC-CIK细胞能促进肿瘤细胞凋亡超微结构的改变。流式细胞(FCM)检测癌细胞增殖周期中的变化;实验组三组与对照组比较G0/G1期细胞比率、AI显著升高,S期无明显变化,G2/M期细胞比率、PI显著下降;去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分两组G0/G1期细胞比率、AI明显高于未去除CD4~+CD25~+Treg组,G2/M期细胞比率、PI显著低于未去除CD4~+CD25~+Treg组,S期无明显变化。去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分两组之间比较G0/G1期、S期、G2/M期细胞比率和AI、PI均没有明显差异(P >0.05)。采用MTT法检测培养前去除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CIK细胞组,培养后去除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CIK细胞组和未去除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CIK细胞组三组效应细胞对于B16黑色素瘤细胞的杀伤作用,结果表明三组效应细胞对肿瘤细胞都有较强的杀伤作用。培养前去除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CIK细胞组和培养后去除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CIK细胞组对B16黑色素细胞的杀伤作用明显高于(P<0.05)未去除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CIK细胞组。且不同效靶比之间比较,效靶比越高杀伤作用越强。培养前去除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CIK细胞组和培养后去除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CIK细胞组两组之间比较对B16黑色素细胞的杀伤作用没有显著性差异(P >0.05)。结论:1、特异性抗原致敏的DC-CIK细胞对B16黑色素瘤具有明显的抑瘤作用,并且对B16黑色素瘤的肿瘤细胞有较强的杀伤作用。特异性抗原致敏的DC-CIK细胞可以影响肿瘤细胞的细胞周期,并且具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。说明CIK细胞是一种具有强大肿瘤杀伤能力的新一代过继免疫抗肿瘤细胞。2、去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分后的特异性抗原致敏的DC-CIK细胞抗肿瘤免疫的作用更加高效而且特异,说明CD4~+CD25~+Treg细胞能够对特异性抗原致敏的DC-CIK细胞杀伤肿瘤细胞的活性形成明显的抑制。去除CD4~+CD25~+Treg细胞,重新募集效应性T细胞能够增强机体的抗肿瘤作用,这将成为一种可行的肿瘤免疫治疗方法。3、不同时段去除CD4~+CD25~+Treg细胞后,从抑瘤作用、对于肿瘤细胞的细胞周期的影响和对肿瘤细胞的杀伤作用上都有一定的差异,但没有统计学意义,说明CD4~+CD25~+Treg细胞各个亚群的来源和作用机制还需要进一步的研究。