论文部分内容阅读
木聚糖酶可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖,内切β-1,4-木聚糖酶以内切方式水解木聚糖分子中的β-1,4糖苷键,是一类重要的半纤维素酶。木聚糖酶在造纸、饲料、食品等行业和能源科学上都有着广泛的应用前景。来源于橄榄绿链霉菌(Streptomyces olivaceoviridis)A1的木聚糖酶XYNB是一种性质优良的木聚糖酶,具有高比活性,抗胃蛋白酶和胰蛋白酶,已在饲料中作为添加剂应用。但该酶的热稳定性一般,在应用上存在不足。 本研究从提高该酶的热稳定性入手,通过定点突变和DNA shuffling的方法对木聚糖酶XYNB进行定向改良,将突变酶在毕赤酵母中表达纯化并对其酶学性质进行分析,以确定突变效果。同时,对该酶的催化残基、影响最适pH的因素也做了一定的分析。 通过定点突变的方法,获得了热稳定性有所提高的突变酶N13D、S40E、T11Y、XS和TB。其中,突变酶N13D和S40E在70℃处理5min,热稳定性分别比XYNB提高了24.76%和14.46%;T11Y突变酶在70℃处理10min,热稳定性是XYNB的2.8倍;增加二硫键的突变酶XS在70℃的半衰期由XYNB的3min提高到9min;氨基端替换获得的融合酶TB,热稳定性较XYNB有很大的提高,在70℃的半衰期由XYNB的3min提高到20min。 再对以上突变位点进行优化组合,获得了突变酶TS(氨基端替换结合二硫键的加入),最终比XYNB在70℃处理20min的热稳定性提高了12.4倍,半衰期由原来的3min提高到150min。突变酶TS由于具有很好的热稳定性和pH稳定性,在工业上有较好的应用前景。 通过同源建模和定点突变,获得突变酶E87F、E177F和N46D。突变酶E87F、E177F的酶活性几乎完全丧失,推断E87、E177是木聚糖酶XYNB的催化残基。突变酶N46D的最适pH值由5.2下降到4.2,pH稳定性也向酸性pH偏移,同时,最适温度和热稳定性也有一定的提高,结果证实木聚糖酶XYNB的第46位的氨基酸与其最适pH值相关,并对酶的酸碱催化反应起重要的作用。 通过DNA shuffling的方法构建木聚糖酶XYNB的突变体库,定向筛选热稳定性有所提高的突变酶,从700个表达菌株中筛选出sh-94#突变酶,将突变酶基因在毕赤酵母中表达,研究发现,sh-94#在70℃的热稳定性较野生型酶XYNB提高了1倍。又筛选到sh-17#突变酶,它的最适温度由原酶的60℃下降到40℃,热稳定性有所下降。初步建立了应用DNA shuffling的方法对木聚糖酶XYNB进行热稳定性的定向改良的研究体系,为今后木聚糖酶的进一步改良奠定了基础。 本研究通过基因工程的手段,定向改良了木聚糖酶XYNB的热稳定性,推测出了木聚糖酶XYNB的催化残基并分析了在催化反应中起重要作用的氨基酸残基。研究中获得的一系列突变酶对研究木聚糖酶结构和功能的关系起到了重要的作用,对指导木聚糖酶的进一步改良提供了良好的研究材料。