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单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM,简称单增李斯特菌）是李斯特菌属的代表种,能引起人和多种动物的李斯特菌病。LM为细胞内寄生菌,其致病性依赖于细菌毒力因子的产生,其中最主要的毒力因子为单增李斯特菌溶血素O（Listeriolysin O,LLO）。LLO由hly基因编码的一种蛋白,分子质量为58.6ku～60ku,是一种孔形成毒素,能够协助细菌破坏吞噬体,促进菌体进入胞液,是细菌得以在细胞液内增殖的先决条件,也是主要的毒力因子,它的缺失将会导致细菌毒力的全部丧失。为了进一步研究单增李斯特菌溶血素O治病机理及其相关生理功能,单克隆抗体（简称单抗）是必不可少的工具。LLO为LM的特异性蛋白,因此,研制抗LLO的特异性单抗,并以此为基础研制检测LLO的ELISA方法,为深入研究LLO蛋白的相关功能,及单增李斯特菌的检测提供基础。本研究由四个部分构成,第一部分是将重组菌进行原核表达,获得LLO原核表达蛋白,用8 mol/L尿素溶液溶解包涵体蛋白,以镍离子亲和色谱柱进行亲和纯化,以梯度尿素溶液进行包涵体蛋白的重折叠。第二部分是以重折叠的LLO免疫Balb/c小鼠,取阳性鼠脾细胞与杂交瘤细胞进行融合,通过多克隆及单克隆筛选,最终获得抗LLO的单克隆抗体;第三部分是制备兔抗重折叠LLO的多克隆抗体,以200μg/次的剂量免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;第四部分是以亲和力高的单克隆抗体为包被抗体,以兔抗LLO多抗为检测抗体,初步建立检测LLO的间接夹心ELISA方法。（1）取重组菌做原核表达,超声破碎获得包涵体蛋白,以8 mol/L尿素溶液溶解包涵体蛋白,用镍柱进行亲和纯化,以梯度尿素溶液对纯化的包涵体蛋白进行重折叠,用PEG20 000进行浓缩,获得近似生理状态的LLO蛋白。（2）以重折叠LLO免疫Balb/c小鼠,20μg/只,2周后,同样剂量加强免疫,佐剂为弗氏不完全佐剂,共加强免疫3次,其间间隔2周。每次加强免疫1周后尾静脉采血,间接ELISA方法检测血清抗体效价,直至抗血清最大稀释倍数为1×105时,其OD450 :对照血清OD450≥2.1,且其OD450≥1.0时,选择效价最高的小鼠于融合前3 d尾静脉加强免疫,3 d后取小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA筛选及3次连续亚克隆,获得了2株可稳定分泌抗LLO蛋白的杂交瘤细胞株（2B4-C8,3F5-G3）,小鼠体内诱生法制备腹水。对杂交瘤细胞株及其培养上清中单抗与腹水单抗进行了一系列鉴定。结果显示,其腹水效价为1∶1×105（3F5-G3）和1∶1×107（2B4-C8）;染色体数目为97±5条（3F5-G3）和93±8条（2B4-C8）,且观察到标志染色体;相对亲和力常数为0.49μg/mL（3F5-G3）和0.26μg/mL（2B4-C8）;抗体亚类均为IgG1,轻链均为κ链;特异性鉴定结果表明2株抗体均与LLO蛋白发生特异性反应,而与载体蛋白无反应。证实本研究制备了抗LLO的特异性单克隆抗体。（3）取重折叠LLO免疫新西兰大白兔,用两种免疫方法免疫动物,每次免疫剂量为200μg,一种免疫方法为常规免疫方法,即首次免疫以等量的完全佐剂进行乳化,背部皮下多点注射,2周后,以等量的不完全佐剂乳化后,背部皮下多点注射,2周后,以不完全佐剂乳化后,进行第三次免疫;新的免疫方法,首次免疫同常规免疫方法,4 d后再次以完全佐剂乳化后,背部皮下注射,第30 d以不完全佐剂乳化后进行免疫。经3次免疫后,获得了兔抗LLO的多克隆抗体。经生物学统计分析,两种免疫方法所获得的免疫效果差异极显著,即新的免疫方法具有一定的应用价值。（4）取亲和力较高的单克隆抗体株,作为包被抗体,以重折叠LLO免疫制备的兔抗LLO多抗为检测抗体,建立检测LLO的间接夹心ELISA体系,优化了夹心ELISA的检测条件,初步建立了检测LLO的间接夹心ELISA方法。