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鸡传染性支气管炎(avian infectious bronchitis, IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus, IBV)引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。由于IBV变异频繁,血清型复杂,所致疾病的临床表现差异较大,在不同地区和不同时间的地方流行毒株总是以各种形式出现,所以对于IBV的分子生物学研究和与病毒入侵相关受体的研究成为一个重点。IBV纤突糖蛋白(Spike, S)是位于病毒粒子表面的结构蛋白,它既有介导机体产生病毒中和抗体的抗原表位,具有良好的免疫原性,又含有介导病毒侵入宿主细胞的受体结合域,是冠状病毒入侵和繁殖的关键蛋白。1.本实验成功构建了编码IBV Beaudette株S1基因的pET-S1原核重组表达质粒,并在E.Coli Rosetta中进行了原核表达,获得了大小为63 Ku的目的条带,使用IBV全病毒多抗进行Western blot证实所表达的蛋白为IBV S1蛋白。2.利用噬菌体随机十二肽库,以IBV S1重组蛋白为靶分子,进行了四轮生物淘选。对第四轮洗脱物进行功能鉴定,淘选出10个噬菌体单克隆进行序列测定,推导多肽序列,结果表明,最终筛选出三个可以与IBV S1蛋白特异性结合的噬菌体,推导氨基酸序列为LWAQAKSLHTLA, MYSPRPPALSTV, HWDPFSLSAYFP,分别命名为L,M,H多肽,ELISA实验证明H多肽可以和S1蛋白特异性的结合,并且可以和gAPN蛋白竞争结合S1蛋白,同时H多肽可以和gAPN的多克隆抗体结合,证明所筛选出的多肽H可以模拟gAPN的抗原表位,gAPN可能作为IBV的受体和IBV的S1蛋白结合。病毒体外抑制实验表明所筛选出来的多肽H具有良好的抗病毒活性,可以有效的抑制IBV感染Vero细胞,当多肽的浓度为500μg/mL时,抑制率最大为59.6%。3.利用筛选得到的噬菌体,建立了IBV的噬菌体介导ELISA检测方法,该方法可以有效的检测到IBV抗原,检测的最低病毒量为1.21×105copeis/μL,并具有较高的特异性,同时将所建立的ELISA方法与RT-PCR法和Real-Time PCR进行了比较,检测的敏感性依次为Real-Time PCR, RT-PCR法和噬菌体ELISA法。4.用FITC标记的H多肽进行免疫荧光,在Vero细胞和CEK细胞上证明了所合成的FITC标记的多肽可以有效的与IBV结合,并对鸡在感染IBV M41后体内病毒的分布进行了研究,证实了在气管、肺脏和肾脏均能有效的检测到病毒的分布,在感染后第1d即可在气管内检测到病毒,第3d可以在肺脏和肾脏中检测到IBV,气管持续到17 d,肺脏持续到7 d,肾脏持续到10 d,兔抗IBV多抗的检测结果是气管2-10 d,肺脏2-6 d,肾脏2-7 d,证明标记多肽的效果优于多克隆抗体,具有成本低,特异性好,操作方便的优势。5.克隆了鸡氨基肽酶N(gAPN)基因全长共2 906 bp,构建了pET-gAPN原核重组表达质粒,并在E.Coli Rosetta中进行原核表达,得到了大小为113 Ku的目的条带。以纯化的gAPN重组蛋白为免疫原制备了多克隆抗体。利用Western blot及间接免疫荧光实验证明此多克隆抗体具有良好的生物学活性,可以与原核表达的蛋白和天然的gAPN蛋白产生特异性的条带和荧光。Western blot实验证实了原核表达的gAPN蛋白可以和IBV结合,免疫共沉淀实验表明gAPN蛋白抗体能沉淀到S1蛋白,为证明gAPN是IBV的功能受体奠定了基础,利用gAPN多克隆抗体在CEK细胞进行病毒阻断实验,证实了gAPN抗体可以阻断病毒感染CEK细胞,gAPN血清稀释度为2-1时阻断率最高,阻断率为81.14%。6.构建了真核表达质粒pcDNA-gAPN,将其转染至Hela细胞,用IBV Beaudette株进行感染,RT-PCR, Real-Time PCR和间接免疫荧光均检测到了IBV的增殖,并绘制了病毒增殖曲线,证明IBV Beaudette株可以感染转染gAPN的Hela细胞,并产生感染性病毒粒子。免疫荧光共定位和激光共聚焦证明了gAPN可以介导IBV感染细胞,gAPN的荧光位于细胞膜,病毒的荧光位于细胞浆内。用不同的IBV毒株进行实验,证实了不同的IBV毒株H120,W93,M41,HH12均能感染转染了gAPN的Hela细胞,证实了实验的可靠性,分别在转染gAPN之后的12和24 h感染IBV Beaudette株,在接毒后12 h、18 h、24 h、36 h、48 h测定病毒的滴度,证实了少量的gAPN即可介导病毒的感染,感染量与gAPN的表达量呈正相关。分别构建了真核质粒pCDNA-gAPN 945和pCDNA-gAPN1695将gAPN进行了截短表达,通过间接免疫荧光证实了gAPN的受体结合部位位于gAPN的945～1695 bp之间,对比pAPN的蛋白质结构后确定了三个位于β转角的可能作为IBV S1蛋白的结合位点,为最终确定gAPN的受体结合部位奠定了基础。