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’琯溪蜜柚’[Citrus maxima(Burm.)Merr.]因其皮薄、汁多、果实风味浓郁、味美而闻名国内外,但在琯溪蜜柚果实生长发育及采后贮藏期间发生的汁胞粒化现象已成为影响柚品质的最突出问题,而木质素在柚汁胞细胞壁的异常积累,是粒化汁胞形成的主要原因之一。因此本研究以’琯溪蜜柚’为材料,克隆了木质素合成途径中的关键酶咖啡酸-O-甲基转移酶(cmCOMT)基因序列,获得了其中一条基因的5’侧翼序列,对克隆到的cDNA、基因组序列及相关启动子进行生物信息学分析,同时还对其进行了原核表达与基因表达分析,初步讨论了 cmCOMT在柚汁胞粒化过程中的调控作用。1 ’琯溪蜜柚’汁胞cmCOMTs基因序列克隆及定量表达分析克隆了 3个木质素合成相关的关键酶基因cmCOMT1/2/3,分别具有1101bp、1092bp、1092bp的开放阅读框,各自编码366、363和363个氨基酸;以’琯溪蜜柚’粒化汁胞的DNA为模板,克隆获得cmCOMT1/2/3基因相应的基因组DNA序列,cmCOMT1/2/3基因组全长分别为4030bp、2204bp、3221bp。生物信息学分析表明:cmCOMTs蛋白均为亲水性稳定蛋白;均有AdoMet_Mtases超家族和二聚化作用超家族保守结构域;二级结构均由α螺旋、延伸链和无规则卷曲组成,在三个蛋白中无规则卷曲所占的氨基酸和比例均最大;都存在跨膜螺旋,cmCOMT1/2/3都倾向于由内到外进行跨膜运动,cmCOMT1/2倾向于N末端朝外,而cmCOMT3的跨膜模式倾向于N末端朝内;cmCOMTs蛋白磷酸化修饰主要以丝氨酸为主,且cmCOMT1蛋白的丝氨酸含量最多为12个。对’琯溪蜜柚’汁胞发育过程中的10个时期2个部位的cmCOMT1/2/3基因相对表达量进行定量分析。cmCOMT1在花后157d前的几个时期表达量无显著差异,期间cmCOMT1相对表达量很低,趋于零,花后157d后表达量开始显著上升,在花后21 1d的粒化汁胞(取样时期中粒化最严重)中基因的表达量均最高,且靠近中柱的汁胞表达量高于远离中柱的汁胞;cmCOMT2/3的表达情况在粒化过程并无显著差异,花后117d的近中柱汁胞中cmCOMT2/3的表达量高于同基因其他时期和部位的表达量,在花后107天的远中柱汁胞中cmCOMT2表达量最低,在花后95d的远中柱汁胞中cmCOMT3基因的表达量最低。比较cmCOMT1/2/3基因在柚果实发育过程中的表达量变化情况,cmCOMT1的相对表达量显著高于另两个基因的表达量,且在花后211d(取样时期中粒化最严重)相对表达量达到最高峰。cmCOMT1/2/3基因的定量表达结果表明cmCOMT1与汁胞粒化相关性显著,cmCOMT2/3与汁胞粒化没有显著相关性。2 ’琯溪蜜柚’汁胞cmCOMT1基因原核表达及启动子克隆分析已从’琯溪蜜柚’汁胞中克隆到3条cmCOMT基因,对’琯溪蜜柚’ 10个时期2个部位汁胞cmCOMT1/2/3基因的表达情况进行了定量分析,结果表明cmCOMT1与汁胞粒化相关性显著,为进一步研究cmCOMT1基因的相关酶学功能,构建了 COMT1基因的原核表达载体,并转化到Transetta(DE3)菌株中诱导融合蛋白表达,37℃0.5mMIPTG诱导5h可溶性表达了融合蛋白,经亲和层析柱纯化,得到了浓度较高的融合蛋白,SDS-PAGE结果表明纯化得到的蛋白纯度较高,蛋白分子量约为39KD。质谱鉴定结果进一步证明了所克隆得到的COMT1序列为咖啡酸-O-甲基转移酶基因,其编码的产物为咖啡酸-O-甲基转移酶。本研究采用Tail-PCR法分离到cmCOMT1基因的5’调控序列,序列长为949bp,利用在线预测软件BDGP分析预测所获得cmCOMT1基因5’端调控序列可能存在的核心启动子区域有3个,分值分别为0.85、0.81和0.98,分别位于第244-294bp、第508-558bp和第822-872bp之间。软件预测结果表明cmCOMT1基因的5’调控序列含有常规作用元件如TATA-box及CAAT-box,还含有响应乙烯、赤霉素及水杨酸的顺式作用元件,响应MYB类转录因子的元件,胚乳表达响应元件(GCN4-motif和Skn-i)和大量的功能未知或功能特异元件。