Apigenin对人卵巢癌细胞系CAOV3的抑制作用及相关机制研究目的卵巢癌生长迅速而且发病隐匿，直到晚期才会引起临床症状，所以卵巢癌的死亡率在妇科恶性肿瘤中高居首位。化疗是晚期卵巢癌的重要治疗手段。然而由于化疗药物有的化疗副作用大，还有的患者会逐渐产生耐药性。因此，寻找抑瘤效果好、副作用小、不存在交叉耐药性的新药成为我们的努力方向。肿瘤是一种多因素所致、多步骤发生、多基因突变的进化性疾病。调节细胞周期、抗凋亡及促进新生血管形成与肿瘤的形成密切相关。Survivin是一种同时具有调节细胞周期和抗凋亡双重功能的蛋白，并且是迄今发现的最强的凋亡抑制因子。Survivin与p21可以竞争性地与CDK4结合，形成survivin／CDK4复合物，使p21从与CDK4／p21结合的复合物中释放出来，这使细胞周期免受p21蛋白的抑制，促进细胞增殖。Survivin可以与caspase-9结合，激活经典的线粒体通路，也可以通过死亡受体通路发挥抗凋亡作用。Caspase-3是线粒体通路与死亡受体通路凋亡途径的交叉点，是凋亡途径的必经之路。Survivin可以与caspase-3结合抑制其活性，触发凋亡。研究还发现survivin表达与血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)表达呈正相关，并且VEGF能诱导人脐静脉内皮细胞的survivin表达明显上调。Survivin几乎在所有肿瘤中均有表达，在绝大部分已分化的正常组织中不表达。抑制survivin表达的最直接后果就是肿瘤细胞周期阻滞和细胞凋亡，而正常细胞却不受影响，因而提示这是肿瘤治疗的理想靶点。天然药物因为副作用低、疗效高而成为近年研究的热点。Apigenin是一种黄酮类化合物，广泛存在于多种水果和蔬菜中。它具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、镇静等作用，其中以抗肿瘤作用最为突出。尽管apigenin抗肿瘤的确切机制尚不十分清楚，但大量研究表明，apigenin的抗肿瘤作用可能通过不同的信号传导通路，抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤新生血管形成，抑制肿瘤细胞侵袭和转移。Apigenin能否抑制人卵巢癌细胞系CAOV3增殖以及是否通过survivin通路在恶性肿瘤中发挥作用，均未见报道。本研究通过观察apigenin在阻滞细胞周期和诱导凋亡等抑制肿瘤细胞增殖方面的显著药理作用，为研究apigenin作为一种新的化疗药物提供理论依据。并且为进一步探讨饮食结构与卵巢癌的关系，以及通过选择合理的饮食结构，寻找切实可行的卵巢癌预防手段提供依据。方法1、用倒置相差显微镜、四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法和流式细胞术(flow cytometer，FCM)法，观察apigenin对CAOV3细胞增殖的影响。用倒置相差显微镜观察10、20、40、80、160μMapigenin作用CAOV3细胞48h后，与对照组相比较，CAOV3细胞的形态变化。用MTT方法，分析10、20、40、80、160μM apigenin作用CAOV3细胞48h后，以及80μMapigenin作用CAOV3细胞24h，48h，72h后与对照组相比，CAOV3细胞的生长情况。用FCM方法，分析10、20、40、80、160μM apigenin作用CAOV3细胞24h、48h后，CAOV3细胞周期的变化情况。2、用免疫组织化学(streptavidin，SP)、逆转录—聚合酶链反应(reversetranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)和Western blot方法，分析apigenin对CAOV3细胞增殖抑制的作用机制。用SP方法观察80μMapigenin作用CAOV3细胞72h后与对照组相比，CAOV3细胞中survivin蛋白的表达。用RT-PCR方法分析10、20、40、80、160μMapigenin作用CAOV3细胞48h后，以及80μMapigenin作用CAOV3细胞24h，48h，72h后与对照组相比，apigenin对的CAOV3细胞中survivin、p21、caspase-3和VEGFmRNA转录的影响。用Western blot方法分析apigenin对CAOV3细胞中survivin、p21和caspase-3蛋白表达的影响。3、用SP法和RT-PCR方法分析survivin和VEGF在卵巢癌和正常卵巢中的表达情况。用SP法分析38例卵巢癌组织和8例正常卵巢中survivin和VEGF蛋白的表达情况。用RT-PCR方法分析20例卵巢癌组织和4例正常卵巢中survivin和VEGFmRNA的表达情况。4、统计学分析：实验数据以x±s表示，采用SPSS10.0统计软件包，计量资料用成组比较t检验，计数资料用x~2检验，用Spearman和Pearson进行相关分析，检验水准α=0.05。结果1、观察apigenin对CAOV3细胞增殖的影响。10、20、40、80、160μM apigenin作用CAOV3细胞48h后与对照组相比，随着药物剂量的增加，实验组形态不规则，细胞密度逐渐降低，细胞间隙逐渐增宽，细胞体积逐渐缩小，细胞内颗粒逐渐增多。160μM时，可见大量坏死细胞碎片。对照组细胞形态规则，细胞外观呈长梭行，细胞膜完整，染色质分布均匀。MTT结果：10、20、40、80、160μMapigenin抑制率分别为2.7％，9.0％，24.5％，42.8％，63.8％，随着剂量增加抑制率逐渐增加(P<0.01)。并且80μMapigenin作用CAOV3细胞24h，48h，72h后，抑制率分别为13％，43％，68％，随着时间延长抑制作用明显增强(P<0.01)。随着apigenin剂量的增加和作用时间的延长，CAOV3细胞的增殖抑制越来越明显，表现出良好的剂量依赖性和时间依赖性。FCM结果：10、20、40、80μMapigenin作用CAOV3细胞24h后，G2／M期细胞比例由6.45％逐渐升高到43.17％，G0／G1期与S期所占百分比逐渐减少，表现出G2／M期阻滞。Apigenin作用48h后，G2／M期细胞所占百分比由0.49％升到63.2％，G0／G1期与S期所占百分比明显减少，G2／M期阻滞较24h更加明显。并且80μMapigenin作用24、48h均出现凋亡峰，即亚G1期细胞(凋亡细胞群)。2、分析apigenin对CAOV3细胞增殖抑制的作用机制。免疫组化结果显示：对照组CAOV3细胞的胞浆内几乎全部可见棕黄色颗粒，即survivin蛋白表达阳性。80μMapigenin作用CAOV3细胞72h后，survivin蛋白仍然表达，但是表达强度明显下降。RT-PCR和Western blot结果显示：随着apigenin剂量的增加和作用时间的延长，CAOV3细胞中survivinmRNA和蛋白、VEGFmRNA表达下调，但p21和caspase-3的mRNA和蛋白表达上调。3、Survivin和VEGF在卵巢癌和正常卵巢中的表达情况。免疫组化结果显示：survivin和VEGF在卵巢癌中均高表达。27例survivin阳性的卵巢癌病例中，19例VEGF呈阳性表达，二者共表达为50.00％。11例survivin阴性病例中8例VEGF呈阴性表达，同时不表达为21.05％。统计学分析表明，survivin和VEGF的表达呈正相关(P<0.05)。RT-PCR结果显示：卵巢癌组织中survivin和VEGFmRNA的表达较正常卵巢明显增高(P<0.05)。结论1、Apigenin可以使卵巢癌细胞系CAOV3阻滞在细胞周期的G2／M期，并能诱导其凋亡，发挥其抑制CAOV3细胞增殖的作用，这种增殖抑制作用具有量效关系和时效关系。2、Apigenin可以下调CAOV3细胞中survivin的表达，上调p21和caspase-3的表达，推测apigenin抑制CAOV3细胞增殖的作用机制可能与survivin表达下调继而引起的癌细胞周期阻滞和诱导凋亡相关。Apigenin除可以抑制CAOV3细胞增殖外，还可以下调CAOV3细胞中VEGFmRNA的表达，具有潜在的抗肿瘤血管生成的作用。提示其有望成为一种新的抗卵巢癌药物。3、人卵巢癌组织中survivin和VEGF的mRNA和蛋白均呈高表达，survivin与VEGF蛋白在卵巢癌中的表达呈正相关。本研究体外实验证实apigenin具有下调survivin和VEGF的作用，提示apigenin若作为抗卵巢癌的新药其潜在的临床应用前景相当广泛。