人心钠素是含有28个氨基酸残基的小肽激素，它具有利钠利尿、舒张血管、降低血压，抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统，调节心血管系统和盐水平衡，稳定内环境的重要作用。因而具有广泛的临床应用价值。目前，心钠素药物已经应用于急性心衰的治疗，并在已经完成了急性呼吸窘迫症的临床Ⅱ期试验。尽管作为小肽，心钠素的基因工程技术生产有其特殊的难点，但是利用高效低成本的重组方法大规模制备心钠素比复杂的化学合成方法更具应用前景。本研究的主要目的在于利用基因工程和蛋白质工程的方法，构建含有人心钠素（α-hANP）基因的重组体，在高效表达的大肠杆菌系统中，通过发酵稳定高效地表达心钠素产品，并探索优化心钠素的纯化工艺，快速、高效地大规模生产心钠素基因工程药物。同时，设计分子导向性双功能肽和新的高效心钠素衍生物，探讨“一菌三肽”的基因工程设计与构建的新策略。并且，探索并建立了一种新技术，实现了利用操纵子重复串联技术增加了目的基因的剂量，从而提高目的基因在大肠杆菌系统中的表达水平。论文分为三个部分。第一部分：人心钠素的基因工程研究。包括，高效稳定表达人心钠素的大肠杆菌工程菌的构建；基因工程产品人心钠素的分离纯化以及各项理化指标的检测；基因工程产品心钠素药理学活性鉴定；基因工程产品心钠素中试生产的初步探索。第二部分：“一菌三肽”和心钠素衍生物的基因工程的探索，包括导向性双功能肽DFP2和DFP3的构建、表达、纯化和药理学活性初步鉴定，以及心钠素衍生物sANP2的构建表达。第三部分：利用操纵子重复克隆技术提高外源基因在大肠杆菌中的表达水平的技术路线探索研究。在本文第一部分中，以化学合成并克隆的人心钠素基因为模板，利用PCR法在28肽ANP基因的3’引入凝血酶识别序列Gly-Val-Arg-Gly-Pro-Arg的编码片段Ad，再在3’以P1噬菌体基因Ref的片段编码保护肽，构建Ref-Ad-ANP融合基因。将其亚克隆组装于P_L启动子下游，构成表达性操纵子P_L-SD-Ref-Ad-ANP-rrnBT₁T₂，构建成CI857ts调控下的温度诱导型重组质粒pCW111，转化入大肠杆菌DH5α，42℃热诱导实现了融合蛋白Ref-Ad-ANP的诱导表达。表达产物以包涵体形式存在于大肠杆菌中。为了进一步提高目的蛋白的表达水平，再将长2.25Kb的P_L-SD-Ref-Ad-ANP-rrnBT₁T₂的全套操纵子重复到同一质粒中，所得的质粒pCW111、pCW112、pCW113和pCW114分别含1-4个操纵子，融合蛋白的表达量得到提高，分别为菌体总蛋白的45％、51％、55％和58％。在第一部分中除了优化实验室摇瓶温度诱导发酵技术，还探索了10L发酵罐中高密度培养工程菌DH5α／pCW112的发酵工艺，每升发酵液得菌体约100克，表达水平为25％左右。收集的细胞经破碎、洗涤提取得到包涵体，溶解后的包涵体在变性的条件下通过反相层析纯化融合蛋白Ref-Ad-ANP，纯度达到90％左右。然后对融合蛋白的凝血酶切割条件进行了优化，在优化的含有2M尿素的缓冲体系下确保了90％以上的切割效率。释放的ANP经过凝胶过滤，得到纯度85％以上的初产品，再经过反相层析精细纯化，获得纯度95％以上的终产品。实验与理论值完全相符或与标准品一致，室摇瓶培养的获得的产品不低于3mg／L发酵液。对基因工程产品心钠素按照药物生产的要求，进行了各项理化指标的鉴定，包括，高分辨率飞行时间质谱对产品分子量的鉴定；N端的20个氨基酸残基的序列测定；氨基酸组成的测定；等电聚焦毛细管电泳对等电点位和纯度的测定；高压液相的纯度鉴定分析。元二色谱对其二级结构的分析等，都与理论值完全相符或与标准品一致，达到了重组基因工程药物的规范要求。在药理活性的初步鉴定中，产品心钠素在体内降压、体内利尿和体外舒张血管方面与标准品的活性相同。实验室成果已转让深圳国家生化工程技术中心进行中间试制和临床试验。笔者在中试生产的初步探索工作中，对高密度发酵、包涵体提取、融合蛋白和心钠素纯化的放大工艺进行了成功的改进，为大规模生产打下了基础。本文的第二部分中，首先利用PCR法将突变引入白细胞介素2，得到IL2衍生物IL2a基因，克隆测序确证后，将其与Ad-ANP片段融合形成IL2a-Ad-ANP基因，表达产物DFP3是具有导向双功能的融合蛋白，实现了“一菌三肽”融合基因的构建。类似于第一部分，DFP3基因同样亚克隆组装于P_L启动子下游，构成表达性操纵子P_L-SD-DFP1-rrnT₁T₂，构建成重组质粒pCW120，在大肠杆菌通过热诱导表达出包涵体形式的目的蛋白，分子量为19244D。但表达水平不足30％。为了提高DFP3的表达水平，又采取亚克隆法，调整了SD序列与DFP3起始密码子之间距离，增加了两个核苷酸TA。构建了表达质粒pCW121，再同样经过操纵子的重复克隆，使DFP3实现更高水平的表达，构建的质粒pCW121、pCW122、pCW123和pCW124分别含1～4个操纵子，DFP3的表达量分别为菌体总蛋白的32％，43％，47％，51％。对工程菌DH5α／pCW122经摇瓶培养获得的包涵体进行洗涤纯化，并通过缓慢稀释复性和枸橼酸酐修饰复性，实现了融合蛋白的正确折叠。在经过离子交换和凝胶过滤层析，获得了纯度95％左右的DFP3产品。对该融合蛋白进行的体内利尿和体外舒张血管方面的药理初步实验表明它同时具有与标准品心钠素相同的活性，从而可消除了IL2导致的急性少尿毒性，并具有消除高剂量IL2所引起的急性肾衰的前景。若经过凝血酶的切割DFP3可以释放出具有心钠素和白介素活性的两种重组药物，从而初步肯定了“一菌三肽”融合基因的构建思路。该成果已获得了发明专利。在第二部分中，还以类似的方法构建了IL2a-Ad-sANP2的融合基因高效表达载体pWXM5，表达水平为39％，其中的sANP2是的22肽衍生物，它与天然28肽心钠湘比，缺失了第1-6位氨基酸并且原第8位Phe密码子改为Thr密码子，原第12位的Met密码子改为ILe密码子，这样构建的衍生物目的在于提高其活性和稳定性。本文的第三部分中，进一步深入探讨了我们首创并利用的操纵子重复串联的方法，即将目的结构基因与调控序列，包括强启动子、SD序列、转录终止子等的整个操纵子重复克隆在同一质粒表达载体上，以期增加目的基因的剂量，提高目的蛋白的表达水平。对上述构建的表达质粒pCW11和pCW12两个系列，通过SDS凝胶电泳和激光密度扫描测定目的蛋日表达量、³H-TdR掺入法测定质粒拷贝数的方法，分析了操纵子重复克隆对目的蛋白表达水平的影响，以及质粒拷贝数的变化。本研究表明，操纵子串联增加了目的基因的剂量从而提高了目的基因在大肠杆菌中的表达水平。此外，质粒大小和其拷贝数呈负相关，提示在同一培养条件下，对于特定的大肠杆菌菌株，同一系列的质粒在宿主细胞内的DNA总量在一定程度上相对恒定。本论文的研究内容贯穿了心钠素基因工程重组药物在实验室阶段开发的全过程，通过以上几方面的实验研究，创新建立了小肽基因工程的技术路线，开发出基因工程重组药物心钠素，以及心钠素衍生物，实现了“一菌三肽”的构想。其中的部分结果申报和获得了两项国家发明专利，本研究的心钠素重组药物的实验室成果已经转入并完成中试生产并进行了药效、药理毒理等临床前研究，目前，正在申报作为国家二类新药进入临床试用。