论文部分内容阅读
大豆（Glycine max）是世界上最重要的经济作物。由于大豆在遗传转化方面的极端顽固性，到目前为止大豆功能基因组学研究和采用转基因技术改良大豆农艺性状的尝试只取得了非常有限的成功。因此，进一步优化现有的大豆遗传转化系统或者寻求新的替代方案，以加快大豆功能基因组学研究和转基因大豆新品种培育的进程，仍然是目前面临的一个重要挑战。因此，进一步探索建立稳定和高效的根癌农杆菌介导的大豆稳定转化系统和发根农杆菌介导的嵌合转化系统已经迫在眉睫，是大豆功能基因组学研究和生物技术改良大豆发展所必需的。 和其他作物一样，大豆也受到各种生物（病毒、细菌、真菌感染等）和非生物（如盐分、干旱、高温等）胁迫的影响。目前，盐胁迫是全世界大豆生产所面临的主要威胁，盐胁迫抑制大豆的生长发育，造成大豆大幅度减产。因此，加快培育耐盐的优良大豆新品种是提高大豆作物稳产的一个重要途径。近几十年来，人们一直致力于阐明大豆耐盐的分子机制，并利用正向和反向遗传学研究方法鉴定出一些可以调节大豆对盐胁迫响应的重要基因。此外，最近的研究发现，小的非编码RNA，特别是microRNAs(miRNAs)通过负调控其靶基因，在调节植物生长发育和抗病耐逆（如耐盐）中发挥着非常重要的作用。miR172在调控植物从营养生长到生殖生长的过渡过程中发挥着关键作用，近期研究发现大豆miR172c也是调控植物-根瘤菌的共生固氮过程的关键调控基因。后续我们发现miR172c启动子含有多个与非生物胁迫响应相关的顺式调控元件(ABRE、MYB2AT等)，而且miR172c的表达受盐胁迫高度诱导，说明miR172c很可能介导大豆植物对盐胁迫的响应。 在这项研究中，我们试图解决以下科学问题:第一，进一步优化大豆毛状根转化和稳定的遗传转化体系;第二，对miR172c及其靶基因在植物对盐胁迫响应中的功能进行验证。通过对这两个方面的研究，取得了如下研究进展: 首先，本研究对影响大豆发根农杆菌介导的毛状根转化和根癌农杆菌介导的稳定转化效率的关键条件进行了系统的研究。发现在众多的影响因子中，萌发幼苗的下胚轴长度与转化效率呈直接负相关关系，是影响大豆毛状根转化效率的最关键因子。在四个不同下胚轴长度的外植体中，没有下胚轴的外植体产生的转基因根数量最多，效率最高。另外，还系统分析了苗龄、发根农杆菌的光密度值（OD值）、共培养时间和共培养温度对毛状根转化效率的影响。在此基础上，建立了一个高效的毛状根转化方法:以在光下萌发3天、子叶为淡绿色的大豆幼苗为材料，在子叶和下胚轴结合处切开，将子叶外植体侵染OD值为0.8-1.0的发根农杆菌后在25-28℃黑暗条件下共培养3天，然后转入培养基或者土壤中培养生根。这个优化的转化系统可以很好地用于大豆调控根部性状的相关基因的功能研究。 在根癌农杆菌介导的稳定转化系统优化过程中，首先通过调整共培养期时间和大豆品种威廉82子叶节外植体的再生能力，提高了瞬时基因表达效率。由于子叶节转化方法存在重复性差、效率低和嵌合体转化事件比率高的问题，也试图探索基于愈伤组织稳定的转化系统。重点研究了不同激素对愈伤组织诱导和植株再生能力的影响，发现使用噻苯隆(TDZ)可以较好的诱导子叶节下部切口产生愈伤组织，并通过细胞分裂素和生长素的不同组合实现了愈伤组织的再生。这个新的转化系统为进一步建立高效的大豆稳定转化系统奠定了基础。 其次，采用优化的发根农杆菌介导的毛状根系对大豆miR172c及其靶基因NNC1（Nodule Number Control1）在植物对盐胁迫响应过程中的功能进行了分析。首先，通过qPCR对miR172c响应盐胁迫的表达模式进行了分析，发现75mM NaCl处理可以迅速诱导miR172c的表达。此外，利用优化的毛状根转化系统创制了miR172cpro::GUS转基因根系进一步确定miR172c在盐胁迫下的表达模式。发现在正常情况下，miR172c在大豆根系表达很弱;但在盐胁迫处理条件下，miR172c在根中受到高度诱导并在根中广泛表达。为了进一步验证miR172c在盐胁迫下根系生长及根可塑性发育中的作用，创制了miR172c过表达和活性下降的转基因根系。表型分析结果显示，miR172c过表达和活性降低分别提高和降低毛状根对盐胁迫下的抗性。例如，在盐处理15天后，STTM172-48的初生根的生长量和空载体对照相比减少75％左右，侧根的发育完全消失。这些结果表明miR172c在大豆盐胁迫下根系耐盐性及其可塑性发育中起着关键的调节作用。随后进一步分析了miR172c的靶基因NNC1在大豆根对盐胁迫响应中的作用。发现NNC1基因启动子上面也含有响应盐胁迫的顺式作用元件，而且qPCR结果证明NNC1在盐胁迫下的表达模式与miR172c相反。对NNC1基因RNAi和过表达的植物根系耐盐性分析发现，NNC1-RNAi和过表达的根系对盐胁迫的敏感性和空载体对照的根相比明显增强或降低。这些结果说明NNC1很可能作为miR172c的主要靶基因介导大豆幼苗对盐胁迫的响应。 综上所述，本研究不仅优化了大豆的转化体系，而且明确了miR172c-NNC1是调控大豆耐盐的分子模块。该研究结果为进一步的功能基因组学研究和转基因提高大豆耐盐性提供了支撑和参考依据。