论文部分内容阅读
本论文分析了重组甲醇营养型毕赤酵母在5 L多参数自控发酵罐上生产人血清白蛋白-人白介素2融合蛋白(HSA-IL2)的发酵过程。在使用多种在线传感器和离线检测参数的基础上,应用相关性分析的方法将细胞生长的关键酶(乙醇氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶)酶活和代谢特性相关联。实验结果显示:(1)在菌体生长阶段,G-6-PDH与ICDH的酶活与菌体的比生长速率μ具有显著的正向相关性;(2)甲醇诱导后葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶的酶活分别下降了46.1%和66.8%,说明胞内代谢流发生了迁移:三羧酸循环(TCA)和磷酸戊糖途径(HMP)中代谢流通量下降,甲醇完全氧化代谢成为主要代谢流;(3)在不同控制策略下,乙醇氧化酶的酶活和重组蛋白HSA-IL2表达量也呈现出一定的差异。高溶氧低甲醇控制方式下HSA-IL2的表达量达到27 mg/L,比低溶氧高甲醇条件下的表达量高33.7%。建立了采用高效液相色谱同时测定重组毕赤酵母表达药物蛋白过程中AMP、ADP、ATP、NAD+和NADH的方法,该方法在15 min内便可对上述五种物质进行有效分离与准确测定。本文通过分析胞内AMP、ADP、ATP、NAD+和NADH浓度的变化描述了重组毕赤酵母在菌体生长以及表达药物蛋白过程中的能荷和氧化-还原态变化趋势。研究发现:(1)细胞自身通过调节能荷和氧化还原水平来调控胞内能量物质(AMP、ADP、ATP、NAD~+和NADH)的浓度,引起相应代谢路径代谢通量的改变,进而影响细胞的生长、代谢以及药物蛋白的生物合成;(2)主成分分析(PCA)表明,菌体的呼吸性能在一定程度上体现了菌体胞内生理状态的变化。