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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的以呕吐、腹泻、脱水和哺乳仔猪高致病率、高死亡率为主要特征的一种接触性肠道传染病,给养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV的S蛋白是诱导产生保护性中和抗体的结构蛋白。本研究进行了S蛋白抗原区域的筛选,分别构建了携带PEDV S蛋白主要抗原区域S499-650和S499-789区域的重组减毒沙门氏菌疫苗,并以小鼠和仔猪为模型进行了口服免疫规律研究。1.S基因的两种真核表达载体的构建与鉴定根据GenBank中PEDV SC-L株S基因序列,设计特异性引物,采用RT-PCR技术扩增并克隆了S499-650、S499-789基因,并分别将S499-650、S499-789基因插入真核表达质粒pVAXl中,构建重组真核表达质粒pVAX-S499-650、pVAX-S499-789,然后转染COS-7细胞,通过间接免疫荧光及Western-blotting进行了蛋白表达鉴定,重组真核表达质粒可在COS-7细胞中表达目的蛋白,表达的蛋白可与兔抗PEDV阳性血清发生特异性反应,证明真核表达载体构建成功。2.两株携带S基因的重组减毒沙门氏菌的构建及生物学特性研究将真核表达质粒pVAX-S499-650、pVAX-S499-789分别电转化入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建了重组减毒沙门氏菌菌株SL7207 (pVAX-S499-650)、SL7207 (pVAX-S499-789)。将这两株重组菌株分别以1×109CFU/只剂量口服免疫小鼠,对重组菌株在小鼠体内的稳定性、携带目的基因在体内的转录、小鼠体内的增殖、对小鼠的安全性等菌株生物学特性进行研究。结果表明,SL7207(pVAX-S499-650)、 SL7207 (pVAX-S499-789)两株口服菌株均具有较高的稳定性；携带的目的基因可在肠道组织内转录；重组菌在小鼠肝、脾中增殖约5周后逐渐被机体清除；重组菌株对小鼠具有良好的安全性。本研究结果表明减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207可作为PEDV S基因不同抗原片段的呈递载体,为后续开展两种菌株的猪体口服免疫效果比较研究奠定了基础。3.重组减毒沙门氏菌的口服免疫原性研究将15头仔猪,分成5组,分别以1×1012 CFU/头剂量口服免疫重组菌株SL7207 (pVAX-S499-650)、SL7207 (pVAX-S499-789)、同时设PEDV灭活苗阳性对照免疫组和SL7207 (pVAX)、PBS阴性对照免疫组,两周后加强免疫一次。在首免第0、2、4、6周采集免疫仔猪血清样品及黏膜样品,测定血清IgG与肠道黏膜抗体IgA的动态规律与中和活性、血清细胞因子IFN-γ、血清IL-4,外周血T淋巴细胞增殖实验。结果显示：SL7207 (pVAX-S499-650)、SL7207 (pVAX-S499-789)可诱导产生一定水平的血清IgG、黏膜IgA,且抗体具有良好的病毒中和活性,其中,口服疫苗诱导体液IgG的能力不如灭活苗,但诱导黏膜IgA的能力优于灭活苗；外周血T淋巴细胞增殖实验则表明SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207 (pVAX-S499-789)具有良好的免疫原性,可有效刺激T淋巴细胞的增殖；血清中细胞因子测定显示：SL7207 (pVAX-S499-650)、SL7207 (PVAX-S499-789)可激发IFN-γ的分泌,但对IL-4的分泌无明显刺激作用,表明二株口服疫苗菌株主要诱导Th1型T淋巴细胞免疫反应,后续将在攻毒保护试验方面继续深入完善评估。