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背景最近发现血管新生和免疫受抑是白血病发生的重要生物学机制。大量的新生血管与白血病的恶性生长、发展及不良预后密切相关。新生血管还能够耐受化疗，提供多种旁分泌因子维持残留白血病细胞生长。血管内皮生长因子（VEGF）是主要的促血管新生因子，大多数血液肿瘤细胞能够合成分泌VEGF，其介导的血管新生在白血病的病理生理过程中具有重要作用。鉴于VEGF mRNA和蛋白表达水平与白血病血管新生的密切相关，VEGF可能成为白血病抗血管新生有潜力的治疗靶点。已知肿瘤患者体内多存在免疫缺陷或功能受损，肿瘤细胞通过多种细胞和分子机制逃避机体的抗肿瘤免疫反应，肿瘤诱导的免疫缺陷可发生在免疫系统的各个主要环节，其中树突状细胞(DC)分化异常和对T细胞刺激能力的下降是导致肿瘤免疫逃逸的重要因素。研究证实白血病患者体内DC功能受损和数量低下。而肿瘤细胞过量分泌的VEGF除了具有促血管新生活性外，还可通过抑制造血祖细胞来源的<WP=9>DC的分化成熟而发挥免疫抑制作用。目的基于VEGF促血管新生活性和免疫抑制的双重作用，我们拟探讨治疗性阻断VEGF活性以抗白血病血管新生和改善白血病免疫治疗前景。为此本课题采用反义寡核苷酸（AS-ODN）抑制白血病细胞系VEGF表达，观察VEGF下调是否能够增强白血病源性DC介导的抗肿瘤免疫效应，进一步研究核因子NF-κB转录活性在下调VEGF增强DC介导的抗肿瘤免疫效应中的重要作用。为白血病抗血管新生联合免疫治疗提供实验依据。方法1. VEGF AS-ODN抑制白血病细胞VEGF表达1.1白血病细胞系：HL-60和K5621.2 方法采用RT-PCR、免疫组化技术分析白血病细胞VEGF 及其两种受体（Flt-1和KDR）的mRNA和蛋白表达水平。并采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测VEGF蛋白的分泌水平。1.3 VEGF AS-ODN转染白血病细胞观察不同浓度VEGF AS-ODN在不同作用时间对白血病细胞增殖的影响，确定VEGF AS-ODN转染的作用浓度和作用时间用于后续实验。实验分组：VEGF AS-ODN组、错义ODN (MS-ODN)组和不加ODN的空白对照组。各组细胞于37 ℃、5% CO2条件下培养。 <WP=10>1.4 检测VEGF AS-ODN转染后白血病细胞VEGF水平采用RT-PCR、免疫组化、ELISA方法，观察VEGF AS-ODN转染后对VEGF mRNA和蛋白表达分泌的影响。2．VEGF AS-ODN影响白血病源性DC功能及其机理探讨2.1 VEGF AS-ODN转染后K562细胞VEGF表达水平的改变5 μmol/L VEGF AS-ODN转染K562细胞，24 h后收获细胞采用RT-PCR和ELISA方法观察VEGF mRNA和蛋白分泌水平的改变。2.2 VEGF AS-ODN转染后K562细胞诱导DC的方法收获经VEGF AS-ODN作用24 h的K562细胞，在GM-CSF、IL-4和TNF-α细胞因子联合刺激下诱导培养14 d生成AS-K562-DC，收集该细胞用于形态学和免疫功能的检测。2.3 AS-K562-DC细胞形态和细胞表型的鉴定和比较通过光学显微镜和电子显微镜分析，观察AS-K562-DC的形态特征。应用流式细胞技术（FACS）分析其细胞表型（CD40、CD83、CD86和HLA-DR）的表达，并与K562细胞诱生DC（K562-DC）的表型表达水平相比较。2.4 AS-K562-DC免疫学功能的鉴定和比较与K562-DC组比较，①采用同种异型混合淋巴细胞反应（Allo-MLR）观察AS-K562-DC刺激同种T淋巴细胞增殖的能力；②采用细胞毒性实验（CTL），检测AS-K562-DC激发外周血T淋巴细胞对白血病靶细胞的特异性杀伤作用；③利用ELISA 检测AS-K562-DC<WP=11>自分泌IL-12和刺激外周血单个核细胞分泌TFN-γ的能力。2.5 VEGF下调对k562-DC诱生早期NF-κB转录活性的影响① 采用HindIII单酶切鉴定带有NF-κB DNA序列的2×IFN-γtkLuc质粒，小量提取质粒DNA用于转染DC。于AS-K562-DC诱导培养的12 h、24 h收集细胞，质粒DNA转染细胞后继续培养48 h，采用荧光素酶检测系统测定细胞的NF-κB转录活性。结果 1．VEGF AS-ODN抑制白血病细胞VEGF表达1.1 HL-60和K562白血病细胞系表达VEGF及其Flt-1受体，KDR受体仅限于HL-60细胞中表达。1.2 与空白对照组相比较，VEGF AS-ODN（5～10 μmol/L）在体外能够显著抑制K562和HL-60细胞VEGF mRNA及其蛋白表达（P<0.05），且这种抑制作用具有剂量依赖性、时间依赖性。而MS-ODN处理组白血病细胞VEGF mRNA及其蛋白表达水平未见明显改变（P>0.05）。2．VEGF下调增强K562-DC功能及其机理探讨2.1 与野生型K562细胞比较，K562细胞经VEGF AS-ODN作用24 h后其VEGF mRNA和蛋白分泌水平显著下降（P<0.05）。2.2 光镜和电镜观察证实AS-K562-DC具有典型DC的形态特征和超微结构。2.3 与K562-DC比较，AS-K562-DC表达更为丰富的细胞表型、具有<WP=12>更强的刺激同种T淋巴细胞增殖能力和介导特异性CTL抗白血病反应能力，其自分泌IL-12和刺激外周血单个核细胞分泌TFN-γ的能力也显著增强。2.4 VEGF下调增强AS-K562-DC功能的机理探讨与K562-DC组比较，AS-K562-DC在培养早期（12 h、24 h）NF-κB转录活性明显提高（P<0.05），提示抑制VEGF表达增强K562-DC免疫功能的分子机制可能与VEGF参与调节DC诱导早期NF-κB的转录活性有关。结论HL-60和K562白血?