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研究背景痤疮是发生在皮脂腺的一种炎症性疾病,是最常见的皮肤病。中国大陆痤疮患病率为39.2%,欧洲为57.8%,在青少年中的发病率可以达到90%以上,在成年人中,发病率甚至可以达到50%。痤疮好发于面部和胸背部。痤疮病变部位常伴有丘疹、脓疱、结节、囊肿等类型的皮疹,导致患者产生生理性病变和心理上的痛苦。痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acne,P.acnes)被认为是痤疮的病原菌,在痤疮的发生发展过程中,扮演了重要的角色。P.acnes能够诱导局部炎症,在毛囊管上皮角化过度的进程中,也有P.acnes的参与。痤疮发生的重要病理过程是炎症,和肿瘤坏死因子(TNF)通路的激活、补体系统的激活、中性粒细胞的迁移密切相关,控制炎症是治疗痤疮的主要方法。临床上,黄芩是治疗痤疮等皮肤炎症性疾病的常用中药。黄芩苷(C21H18O11)是从黄芩根中提取出来的一种黄酮类化合物,是黄芩的主要活性成分,具有很强的抗炎作用。黄芩苷治疗痤疮的分子机制还有待进一步研究。目的运用Kligman法在新西兰兔中构建兔耳痤疮模型,评估黄芩苷对痤疮的治疗作用。通过对治疗前后兔耳痤疮样本的转录组测序分析并结合免疫组织化学实验和Western blot实验,系统揭示黄芩苷治疗痤疮的分子机制,为黄芩苷治疗痤疮的有效性提供实验证据,为黄芩苷治疗痤疮的临床应用提供依据。方法1.运用Kligman法来建造新西兰兔的兔耳痤疮模型,评价黄芩苷对痤疮的治疗作用。2.通过H&E染色方法评估兔耳痤疮模型建立成功与否,在组织学角度评价黄芩苷对兔耳痤疮模型的治疗效果。3.观察经高、中、低剂量的黄岑苷治疗以后,兔耳痤疮的个数变化,以此为基础,计算出对黄芩苷对痤疮的治愈率。4.游标卡尺测量兔耳痤疮模型和黄芩苷高、中、低剂量治疗后的兔耳厚度变化和痤疮直径变化,评价黄芩苷对兔耳痤疮模型的治疗效果。5.采用酶联免疫吸附法(ELISA)来测定痤疮新西兰兔模型血清中TNFA,IL1B,NFKB1和IL8等炎症因子的表达情况。6.采用转录组测序的方法,检测黄芩苷治疗前后的兔耳痤疮样本中基因的差异表达情况。7.采用免疫组织化学法检测兔耳痤疮模型和黄芩苷治疗后TNFA,IL1B,NFKB1和IL8在痤疮组织中的表达情况。8.采用Western blot实验检测TNFA,IL1B,NFKB1和IL8在兔耳痤疮组织和黄芩苷治疗后兔耳组织中的表达情况。结果1.黄芩苷能够治疗兔耳模型的痤疮。Kligman法构建的新西兰兔耳痤疮模型与正常对照组相比,兔耳的肿胀程度明显加强。经黄芩苷治疗后,兔耳痤疮模型的肿胀程度和痤疮表现得到明显改善,即痤疮模型中的兔耳厚度、痤疮病损的直径明显减小,痤疮病灶的个数明显减少。2.痤疮兔耳模型组织学分析:我们发现痤疮兔耳模型较对照组相比,出现了典型的痤疮造模成功的表现。比如皮肤组织过度角化,表皮及毛囊上皮的颗粒层发生比较明显的增生,毛囊口有角化物堆积,漏斗部扩大如壶状,真皮内部发生炎性细胞浸润较多的现象。经高、中、低不同剂量的黄芩苷治疗后,痤疮兔耳毛囊口的扩张状况明显减轻,其内部的角化物发生明显的疏松现象,炎症细胞也显著减少。3.黄芩苷对新西兰兔痤疮模型血清中炎性细胞因子表达的影响:经酶联免疫吸附法(ELISA法)检测,TNFA、IL1B、IL6、IL8在兔耳痤疮模型血清中的表达量明显升高,经高、中、低剂量黄芩苷治疗后,其含量均显著降低。4.黄芩苷对兔耳痤疮组织基因表达的影响:经转录组测序分析,我们发现对照组、痤疮模型组和黄芩苷治疗组之间有大量的差异表达基因。痤疮模型组和对照组相比,上调基因有1325个,下调基因有1187个。黄芩苷用药组和痤疮组相比,上调基因有350个,下调基因有411个。在痤疮组上调的基因里(和对照组相比),应用黄芩苷后下调的有179个,占黄芩苷用药组下调基因总数的43.6%。和对照组相比,在痤疮模型组下调的基因里,应用黄芩苷后上调的有105个,占黄芩苷用药组下调基因总数的30%。黄芩苷治疗痤疮的有效机制可能是使痤疮组上调的基因得到下调,下调的基因得到上调。5.黄芩苷对兔耳痤疮组织TNF通路的调节作用:对差异表达基因进行KEGG富集通路分析,可以发现,和对照组相比,痤疮模型组差异表达基因主要富集的通路包括TNF信号通路。对差异表达基因进行表达量分析可知,TNF通路中多个关键基因(如TNFA、IL1B、IL8、TNFRSF1B、NFKB1、REL等)的表达量均被上调,而黄芩苷可以显著抑制这些基因的上调。免疫组织化学实验和Western blot实验表明,黄芩苷能显著抑制痤疮发病时TNF通路中TNFA、IL1B和NFKB1的上调。6.黄芩苷对痤疮兔耳模型金黄色葡萄球菌感染途径的抑制作用:经对照组、痤疮模型组和黄芩苷用药组差异表达基因KEGG富集通路分析表明,黄芩苷组差异表达基因主要富集在金黄色葡萄球菌感染途径、吞噬细胞途径、细胞粘附分子、细胞因子受体相互作用和补体凝血级联途径,其中富集最显著的是金黄色葡萄球菌感染途径。金黄色葡萄球菌感染途径包括中性粒细胞的募集、抗原的提呈、补体系统的激活和FCγ受体介导的吞噬作用。经差异表达基因表达量分析可知,参与中性粒细胞募集的4个基因在痤疮组表达上调,应用黄芩苷后下调。免疫组化结果也显示,大量中性粒细胞募集到痤疮部位,并被黄芩苷抑制。补体系统富集了8个差异表达基因,包括5个经典途径特异性基因(C1QA、C1QB、C1QC、C1R和CC1S)、1个旁路途径特异性基因(CFB)、2个经典途径和凝集素途径共有基因(C2和C4BPA)。痤疮组和对照组比,除C2上调不明显外,其他7个补体系统基因均发生了明显上调;痤疮组和黄芩苷组比,除C4BPA下调不明显外,其他7个补体系统基因在黄芩苷处理后明显下调。结论1.黄芩苷可以显著抑制兔耳痤疮模型的痤疮炎症表现。2.黄芩苷可以显著抑制新西兰兔痤疮模型血清中炎性细胞因子的表达。3.痤疮发生过程中多条感染、炎症相关通路被激活,如TNF信号通路、金黄色葡萄球菌感染途径等,黄芩苷治疗能够显著抑制这些通路的活化。研究表明,黄芩苷通过显著抑制痤疮发生过程中多条炎症反应通路的激活,进而改善痤疮症状。我们的研究进一步揭示了黄芩苷治疗痤疮的分子机制,为黄芩苷的临床应用提供了实验依据。