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龋病是人类最常见的疾病之一,自从病因学研究证实龋病为一种细菌感染性疾病以来,研究人员在有关龋病相关微生物及免疫学方面做了大量的研究,以期找到龋病的主要病原菌及可用抗原成分,从而研制出防龋疫苗,从而控制致龋微生物在牙齿表面的粘附定植的初始环节预防龋病发生。 大量研究表明变形链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)与龋病发生、发展密切相关,是主要致龋菌。根据来自不同研究者的报告,与S.mutans在牙齿表面最初粘附定植有关的表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ(AgⅠ/Ⅱ)功能结构域位于分子的N-末端1/3,该区段含有富含丙氨酸的重复区,是与牙齿表面的唾液蛋白受体结合的活性部位,并且证实它在龋病发生过程中起重要的作用,此区段称为唾液结合区段(Saliva-binding region,SBR)。因此,SBR成为防治龋病的主要研究对象。 为了探讨防治龋病的有效方法,我们制备了针对S.mutans的SBR的亚单位疫苗和基因疫苗,并进行了相关的实验研究,初步验证了其免疫原性。首先通过PCR、T-A克隆等技术构建原核表达质粒pTriEx-4-SBR,在大肠杆菌中表达并纯化获得S.mutans SBR蛋白;通过动物实验探讨S.mutans SBR作为亚单位防龋疫苗的免疫原性,评价经涎腺接种诱导有效免疫应答的可行性,探讨在涎腺免疫接种后局部免疫调节相关细胞因子变化状况。其后,我们利用新研制的一种适合于减毒沙门氏菌作为粘膜免疫接种载体的双启动子DNA疫苗表达载体pCMVnir,构建出了含SBR基因片段的双启动子表达质粒pCN-SSIE,并对其作了鉴定;然后用该质粒转化了减毒沙门氏菌SL3261。分别直接应用双启动子质粒pCN-SSIE作为疫苗对小鼠肌内注射和用被这种质粒转化的减毒沙门氏菌经胃肠接种,观察了免疫应答效应,初步证明两利方法均能激起明显的针对S.mutans SBR机体免疫应答。山东大学博士学位论文第一部分:s.mutan,唾液结合区段(SBR)原核表达载体构建、表达与纯化防法]: 1.设计并合成S.脚utan:SBR DNA序列上、下游特异性引物,5’端分别含 有限制性内切酶Ncol和Xbol的酶切位点,利用PCR技术由 peDNA3 .1一SBR扩增编码SBR的DNA片段。 2.纯化回收PCR产物,通过T-A克隆技术将目的DNA片段连接至克隆载 体pMD 18一T;构建出克隆中I旬载体pMD 18一T-SBR。 3.重组的pMD 18一T-SBR在大肠杆菌DHS。内扩增后,经质粒DNA提取、 Ncof和Xhof酶切,筛选出阳性重组子。 4.琼脂糖凝胶电泳回收含有SBR DNA全长的酶切片段,然后在T4DNA 连接酶作用下,将其与pTriEx一4大片段连接,构建出阅读框架正确的原 核表达载体pTriEx一4一SBR;筛选出阳性重组子,并进行基因测序鉴定。 5.将构建的表达载体pTriEx一4一SBR转化大肠杆菌JMlog(DE3)中并诱导表 达SBR蛋白。 6.运用亲和层析的原理应用HisTrap TM蛋白纯化试剂盒纯化出蛋白sBR。〔结果]: 1.通过对重组质粒pTriEx一4一SBR进行酶切鉴定以及DNA序列测定分析, 证明原核表达重组质粒pTriEx一4一SBR构建成功、开放阅读框架正确。 2.sDs一PAGE电泳表明在大肠杆菌JM109(DE3)中诱导表达的蛋白产物条 带大小与预期结果相符,并通过亲和层析的方法纯化得到大小与预期相 符的SBR蛋白。【结论」: 1.构建出含有编码SBR的DNA片段的原核表达载体pTriEx一4一SBR。 2.在JM 109(D E3)中诱导表达出C端含有6个组氨酸标签的SBR蛋白,并 纯化得到可用作防龋重组抗原疫苗的SBR蛋白。第二部分:SBR作为亚单位疫苗经涎腺免疫小鼠后机体抗体应答及局部相关细 胞因子表达变化〔方法】: 1.采用纯化的s.mutan:SBR融合蛋白作为亚单位疫苗经领下腺周围区域注射免疫BALB/C小鼠,ELISA检测特异性抗体指标。应用RT一PCR方法检测接种后领下腺内神经生长因子和白介素一5的相对表达情况。【结果〕:山东大学博士学位论文 1.ELISA结果表明:纯化的SBR融合蛋白经靶向领下腺区域免疫后血清 中特异性抗SBR一IgG抗体升高(P<0.01),唾液中特异性抗SBR IgG 抗体以及抗sBR一IgA抗体均显著升高(P<0.01)。 2.RT一PCR结果表明免疫之后,小鼠领下腺内ThZ型细胞因子IL一5和神 经生长因子(NGF)mRNA的表达量均比对照组高(尸<0.01)。【结论】: 1.本实验所表达及纯化的s.mutan:SBR亚单位疫苗经领下腺接种途径可 诱导明显的抗体应答。 2.汉mutan:SBR亚单位疫苗在领下腺作局部免疫接种,不但可诱导抗体 应答,还可促进免疫调节相关细胞因子的表达,参与免疫应答调节网络 以及促进涎腺分泌功能。第三部分:双启动子质粒pCN一sSIE的构建【方法〕: 1.PCR扩增EGFP、SBR片段,构建出克隆中间载体pMD18一下EGFP质粒、pMD 18一T-SBR质粒。(l)设计引物,用PCR的方法从质粒pEGFP一Nl中扩增出编码EGFP的DNA片段,并在片段的两端分别添加上合适的酶切位点,上游添加的是Sall位点,下游添加的是Notl位点。将编码EGFP的DNA片段连接与TA克隆载体pMD18一T,构建出质粒pMD18一T-EGFP;用pMD18一T-EGFP转化 DH5a感受态细菌,于LA平板上进行筛选。(2)提取质粒pcDNA3.l一SBR作为模板,设计pCR引物,上游添加Notl位点,下游添加EcoRI位点。凝胶电泳纯化PCR反应产物中的SBR片段,与载体pMD18一T进行连接,构建出质粒pMD18?