研究背景及目的：肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常见的原发性肝肿瘤。许多国家HCC的发病率逐年上升,死亡率居高不下。研究认为,肝脏微环境的改变已经成为HCC的病理标志之一,80%以上的HCC是由慢性肝炎-肝纤维化-肝硬化“三部曲”演变而来,同时炎症反应和细胞外基质沉积很大程度上改变了肝脏微环境。近些年,高通量的基因组分析已经逐渐阐明了与HCC发生发展密切相关的基因网络以及信号转导通路,某些重要基因成为肿瘤治疗药物的靶点。但是,HCC的复发和转移仍然困扰着我们,其原因可能与肝癌微环境相关。因此,寻找靶向微环境的药物是我们面临的挑战。肿瘤相关成纤维细胞(tumor associated fibroblasts, TAFs)是肿瘤微环境的主要细胞组分之一,它是由肝星状细胞和肝成纤维细胞等基质细胞演变而来,参与维持肿瘤的标志性特征。同时,TAFs可以增强肿瘤细胞的耐药能力。既往研究发现,胶毒霉素(Gliotoxin)可通过诱导肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)凋亡而显著减轻肝纤维化。低浓度的Gliotoxin (0.1 μM)即可诱导HSC凋亡,而对正常肝细胞无明显损伤,只有当浓度达到30-50 μM时方可引起正常肝细胞坏死。我们近期的实验结果证实低浓度Gliotoxin(IC50=143.1 nM)即可显著抑制TAFs增殖。既然Gliotoxin对肝星状细胞(TAFs的主要来源之一)有很强的杀伤效果,我们推测Gliotoxin可能通过作用于微环境从而对HCC有治疗作用。为了验证这一推论,本研究将从以下两方面展开：首先,分离培养并鉴定人HCC来源的TAFS,观察Gliotoxin对TAFs生物学特性的影响以及凋亡诱导作用；进一步检测Gliotoxin对TGF-β通路及其下游基因的作用；建立TAFs与肝癌细胞株的共培养体系,观察Gliotoxin对共培养细胞的作用其次,建立DEN诱导原发性肝癌模型,研究Gliotoxin对HCC的治疗作用。该研究将肿瘤微环境作为治疗HCC的靶点之一,可能为临床上HCC的治疗提供新的理论依据。实验方法：1.Gliotoxin对TAFs的作用：①分离并鉴定TAFs,将人HCC组织切成2 mm3大小,胶原酶Ⅳ消化、梯度离心后得到TAFs,进一步纯化成纤维细胞。细胞免疫荧光检测α-SMA、Vimentin、Desmin的表达。②Gliotoxin对TAFs生物学效应的影响,体外研究不同浓度Gliotoxin对TAF增殖及迁移的作用：将TAFs以3×103/孔的数量置于96孔板中,加入不同浓度的Gliotoxin培养6天,第6天单荧光素报告基因检测TAFs的增殖情况,计算IC50；选定Gliotoxin合适浓度(100nM)溶于含3%胎牛血清(FBS)的培养基中并加入24孔板,计数5×104的TAFs接种于Transwell小室,24小时后结晶紫固定、拍照,利用ImagePro软件计算TAFs的迁移情况。2.Gliotoxin对TAFs凋亡的诱导作用：①100nM的Gliotoxin处理TAFs后,利用Caspase3荧光试剂盒检测不同时间点TAFs由Caspase3的表达,通过计算Caspase3活性增高倍数评价Gliotoxin对TAFs凋亡的作用。②100nM的Gliotoxin处理TAFs,4小时后收集细胞。Annexin V与碘化吡啶(PI)标记TAFs,流式细胞仪检测凋亡情况,重点分析Gliotoxin对早期凋亡的影响。③不同浓度(0、30 nM、100n M、300 nM)的Gliotoxin处理TAFs,在不同时间点(15 min、30min、 60min、120min、180 min)检测ATP的表达量,分析Gliotoxin对ATP的消耗能力。3.Gliotoxin对TAFs作用机制的初步探讨：①TAFs培养基中加入100nM的Gliotoxin,48小时后提取细胞RNA,使用逆转录试剂盒将RNA逆转为cDNA, Real-time PCR检测TAFs相关标记物-SMA、Vimentin、Desmin、纤维细胞相关蛋白(FAP)以及TGF-β通路下游基因(C-myc、Smad5、AP-1、SP-1、Bcl-2)的表达。②TAFs培养基中分别加入0 nM、30nM、100 nM、300 nM的Gliotoxin,4小时后收集蛋白,定量后western-blot检测TGF-β通路Smad蛋白家族的活化情况；另一组TAFs于24小时后检测TGF-β通路报告基因3TP的荧光表达。4.Gliotoxin对TAFs-肝肿瘤细胞共培养系统的作用：①Gliotoxin处理TAFs后,收集细胞培养上清,同时获取正常培养基、成纤维细胞株(normal fibroblasts, NFs)、TAFs培养上清作为条件培养基。将Hep3B细胞(3x103/孔)分到96孔板,加入条件培养基,CCK-8法检测细胞增殖情况。②24孔板下层加入正常、NFs、TAFs、TAFs-Gliotoxin的条件培养基,transwell小室中加入SMMC-7721细胞(5×104),24小时后结晶紫染色,拍照、计数迁移细胞。5. Gliotoxin对DEN肝癌模型的治疗作用：①Gliotoxin治疗肝癌的效果评估,22周处死所有大鼠,大鼠肝脏给予门静脉生理盐水灌注,取出肝脏。观察肝脏外观的变化。取组织制作石蜡切片,切片后进行HE染色,评估Gliotoxin对肝癌的治疗效果。②Gliotoxin对肝脏纤维化的影响,利用Masson和天狼星红对肝脏组织进行染色,观察胶原的分布情况。图像扫描并计算胶原分布面积；免疫组织化学检测组织中a-SMA的表达。6.统计学处理：数据采用SPSS 16.0统计软件包进行分析,结果以X±SD表示。多组间采用One-Way ANOVA方差分析,P<0.05为统计结果具有显著性差异。实验结果：Gliotoxin具有抑制TAFs的作用：①细胞免疫荧光检测发现TAFs表达α-SMA、Desmin与Vimentin,其中a-SMA与vimentin在所有TAFs中均表达。而Desmin只在部分TAFs中表达。②Gliotoxin浓度低于50 nM时对细胞无明显的杀伤效应。当Gliotoxin浓度在50-400 nM之间时,TAFs的存活率随着药物浓度的升高而迅速降低。根据药敏试验的曲线得到Gliotoxin对TAFs的IC50为147.1 nM.③ Gliotoxin可以抑制TAFs的迁移。30 nM的Gliotoxin即对TAFs的迁移具有一定的抑制作用。100 nM的Gliotoxin处理TAFs可以使TAFs的迁移数量降低至对照组的一半。当Gliotoxin浓度提升至300 nM后,迁移抑制率约为90%。④Gliotoxin促进TAFs凋亡。1)100nM的Gliotoxin处理TAFs后,Caspase3活性检测结果发现,15min开始Caspase3的活性已经开始增加,并且具有一定时间依赖性。180分钟是Caspase3活性最高,为对照组的25倍以上。2)100nM的Gliotoxin处理TAFs,4小时后利用流式细胞仪检测TAFs凋亡情况,结果显示早期凋亡由10.83%增加至16.23%,说明Gliotoxin可以促进TAFs的凋亡。3)ATP含量测试实验表明60分钟时,300nM Gliotoxin处理的TAFs开始消耗ATP,此时中低浓度组的ATP含量无明显变化。120分钟后,100nM Gliotoxin处理TAFs的ATP含量开始下降,而300nM浓度Gliotoxin处理组ATP含量降低幅度已经超过50%。4小时后中、高浓度组的ATP持续维持在低水平。⑤Gliotoxin抑制TAFs中TGF-P通路的活化不同浓度Gliotoxin处理TAFs,4小时后收集蛋白检测TGF-β通路活化情况,我们发现Smad2与Smad3表达无明显差别,但是Smad2/3磷酸化水平显著下降。另外,我们利用TGF-β通路报告基因检测该通路的活化情况,发现Gliotoxin可以抑制TGF-β通路报告基因荧光素酶的含量。利用Real-time PCR检测TGF-β通路下游基因表达,发现Gliotoxin处理后通路下游基因C-myc、Bcl-2以及AP-1表达下调。同时TAFs标记物α-SMA、Desmin、 Vimentin与FAP表达下调。⑥Gliotoxin对TAFs-肝肿瘤细胞共培养系统的作用。1)我们利用NFs、TAFs、TAFs-Gliotoxin的细胞培养上清处理Hep3B细胞,在不同时间点检测肿瘤细胞的数量,结果发现NFs、TAFs均可促进肿瘤细胞株的增殖,但是TAFs的促增殖能力更强,如果TAFs经Gliotoxin处理,它的促增殖能力有所下降,与NFs水平相近。2)NFs促进肿瘤细胞株SMMC-7721迁移的能力较弱,TAFs则显著增强7721细胞的迁移。Gliotoxin可以部分抑制TAFs的促迁移作用。Gliotoxin对DEN肝癌模型的治疗作用：①Gliotoxin治疗肝癌的效果评估。22周处死所有大鼠,取出肝脏。大体观察各处理组肝脏的变化。发现模型组和溶剂对照组肝脏已经出现多发的肝癌结节,或表面出现肿瘤肿块,同时肝硬化程度较重。Gliotoxin治疗组大鼠未见肿瘤肿块。HE染色后评估Gliotoxin对肝癌的治疗效果。结果显示：模型组有6只大鼠被诊断为肝细胞癌,两只大鼠为重度不典型增生；DMSO组5只大鼠被诊断为肝细胞癌,其余为不典型增生。肝细胞癌多数为中高分化,两组中各有一只为低分化肿瘤；Gliotoxin治疗组(0.5mg/kg与1.5mg/kg)各有1只大鼠被诊断为高分化癌,其余均为不典型增生和肝硬化。②Gliotoxin对肝脏纤维化的影响。利用Masson和天狼星红对肝脏组织进行染色,观察胶原的分布情况。结果显示模型组及DMSO组胶原的表达未见明显差异,Gliotoxin治疗组特殊染色面积显著下降。免疫组织化学检测检测α-SMA的表达,发现α-SMA在模型组与治疗组的表达出现显著差异,Gliotoxin治疗组α-SMA表达范围局限于汇管区,而模型组α-SMA表达范围较大,已经延伸至肝细胞所在区域。结论：1. Gliotoxin抑制TAFs的增殖、迁移,促进TAFs的凋亡。2. Gliotoxin对TAFs的抑制作用与TGF-β通路有关。3. Gliotoxin抑制实验性肝癌的进展。