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低氧应激是应激的重要形式之一。为适应低氧环境、进行自我保护,机体形成了在不同氧环境下的基因表达调控机制。促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin-releasing hormone, CRH)家族在机体低氧应激过程中通过调节下丘脑-垂体-肾上腺皮质(hypothalamus pituitary adrenal, HPA)轴、神经内分泌系统、自主神经系统和免疫系统功能,参与调节机体的低氧应激过程,进而稳定机体内环境。促肾上腺皮质激素释放激素1型受体(Corticotropin releasing hormone receptor1, CRHR1)介导CRH生理作用的发挥,其基因表达调控是应激诱导HPA轴反应的关键环节。我们实验室前期研究发现低氧应激激活HPA轴,诱导大鼠等动物脑不同部位以及腺垂体CRHR1mRNA表达上调,提示低氧下转录因子可能通过与其作用元件结合,在转录水平调控CRHR1mRNA的表达。本研究旨在探讨低氧应激下NF-κB和AP-1参与CRHR1转录调节的机制。研究方法将大鼠垂体CRHR1基因5’调控区-2161～+347段不同长度DNA序列亚克隆入不含启动子的萤光素酶载体pGL3中,构建各种质粒,转染AtT20细胞,检测其活性与内参pRL-TK萤光素酶活性比值；利用整体间歇低氧应激动物模型,研究低氧诱导大鼠垂体CRHR1基因表达变化；应用EMSA方法检测转录因子在体外与靶序列结合活性；应用定量RealtimePCR方法检测整体水平CRHR1mRNA的表达。研究结果如下：1.获得大鼠垂体CRHR1基因5’调控区-2161～+347段DNA序列,全长为2508bp,经过生物信息学分析,发现该序列分别含有5个c-jun/AP-1,3个GR,4个NF-κB以及8个HIF-1结合位点。2.成功构建质粒p2161-18T和p2161Luc,分别用于测序和检测CRHR1基因5’端调控区转录活性。根据转录因子结合元件在CRHR1基因5’调控区-2161～+347段的分布,又分别构建了p1833Luc、p1795Luc、p1692Luc、p1289Luc、p1248Luc、 p1218Luc、p1140Luc、p838Luc、p687Luc、p360Luc等系列缺失体质粒。进一步构建了含-809～-800位点的NF-κB结合元件的突变体质粒p838mLuc和含有-1277～1271位点的c-jun/AP-1结合元件的突变体质粒p1289mLuc和以及c-jun的真核表达质粒pcDNA3.1-c-jun.3.发现p2161Luc、p1289Luc、p838Luc在AtT20细胞中的活性随低氧时间延长而呈现增强的趋势,在24小时达到最大值。P2161Luc和p1289Luc的活性在低氧暴露8-12小时期间曲线平缓。4.发现低氧暴露24小时,p838Luc在AtT20细胞中的活性与常氧对照组相比显著增强,这一现象可以被NF-κB抑制剂(PDTC)抑制；而突变体p838mLuc活性无明显增强。大鼠垂体CRHR1基因5’调控区-809～-800区域的结合元件在体外能与AtT20细胞以及大鼠垂体的核蛋白中的NF-κB结合,且低氧进一步增强二者结合活性,此结合可以被PDTC、p65抗体、100倍浓度的冷探针消除；突变探针(-809～-800)不再与NF-κB结合。在整体低压舱模拟5km间歇低氧(10.8%02,4h/d)条件下,CRHR1mRNA表达表现为一个先下降后增强的过程,在第2天表达显著下降,第5天表达上升,二者均可被PDTC反转；7km(7.8%02)连续低氧8h,CRHR1mRNA表达下降幅度更大,此结果同样可被PDTC反转。5.发现大鼠垂体CRHR1基因5’调控区-1277～1271区域的结合元件在体外能与AtT20细胞核蛋白中的c-jun/AP-1结合,低氧暴露进一步增强二者结合活性,此结合可以被c-jun磷酸化抗体、100倍浓度的冷探针消除。突变探针(-1277～1271)不再与c-jun/AP-1结合。p1289Luc转染AtT20细胞,低氧暴露24h后,CRHR1基因5’调控区-1289～+347段的转录活性较常氧对照组增幅达到最大,此增幅可以被2μg pcDNA3.1-c-jun的共表达完全抑制。结论1CRFR1基因5’调控区-2161～+347参与低氧上调CRFR1基因转录。2.证明了大鼠垂体CRHR1基因5’调控区-809～-800位点的NF-κB结合元件促进低氧诱导的大鼠垂体CRHR1基因的转录。3.大鼠垂体CRHR1基因5’调控区-1277～1271位点的结合元件与AP-1在低氧暴露下结合活性增强,在AtT20细胞低氧暴露8～12小时AP-1可能参与抑制CRHR1基因的转录活性。