人类牙齿发育是一个连续的过程,经历了蕾状期、帽状期、钟状期和牙根发育期。牙冠发育完成以后,成釉器内釉、外釉上皮在颈环处增生,向未来根尖孔方向生长,形成两层上皮的鞘,被称为Hertwig上皮根鞘(Hertwig’s epithelial root sheath,HERS)。牙齿发育是外胚上皮和神经嵴来源的间充质相互作用的结果,而牙根是在HERS和周围外胚间充质的相互作用下形成的。HERS在牙根形成中可能起着以下作用:诱导牙乳头细胞分化为成牙本质细胞,形成根部牙本质;当根部牙本质开始矿化时,HERS断裂,牙囊细胞与HERS接触被诱导分化为成牙骨质细胞,生成牙骨质;HERS还有可能直接参与牙骨质的形成。由于HERS在牙根发育中是暂时性结构,而且仅由两层上皮细胞构成,细胞数量少且被外胚间充质细胞包绕,故从牙胚中单独分离HERS细胞相当困难。迄今为止,关于HERS细胞分离培养的报道还很少,HERS的生物学特性和在牙根发育中的具体作用都还不太清楚。本课题的目的是寻找牙根发育中的合适时机,分离培养HERS细胞,进一步研究HERS的生物学特性和其在牙根发育中的作用,为牙根发育和组织工程牙根研究提供实验和理论依据。本课题采用组织学、免疫组织化学、细胞培养、RT-PCR、体内种植和体外培养等技术方法进行了以下四部分实验研究,主要研究内容和结果如下:第一部分大鼠磨牙牙根发育中HERS的观察实验一、采用组织学方法系统观察了出生后(postnatal, PN)SD大鼠下颌第一磨牙牙根发育时序,应用免疫组织化学方法观察了HERS在牙根发育中的生物学行为,结果发现:PN5d时,SD大鼠下颌第一磨牙HERS开始形成,牙根发育启动;PN15d时,在根分叉和牙颈部,牙根硬组织形成,HERS断裂;HERS发生断裂时形态拉长,断裂后呈圆形或立方形;PN35d时,HERS完全断裂,牙根发育完成。实验二、采用免疫组织化学方法检测了牙根发育中HERS和周围外胚间充质增殖活力的变化,结果发现:PN5d和PN7-8d时,HERS增殖力较强;PN15d时,HERS末端保持较强增殖力,但牙胚颈部的HERS增殖力减弱,并发生断裂;PN25d时,根尖处增殖细胞主要是间充质细胞;HERS周围的间充质始终保持旺盛的增殖力。结果表明:HERS的断裂可能是其增殖力减弱,周围间充质保持旺盛增殖力而产生的增殖力差异所致。综合考虑HERS的生长、增殖力和实验操作难度,PN7-8d是分离培养SD大鼠HERS细胞的适宜时机。第二部分HERS细胞的分离、培养和生物学特性的初步研究实验一、通过机械分离牙胚颈部组织,酶消化法原代混合培养,差别消化法去除成纤维样细胞和角质细胞无血清培养液连续培养的方法,分离培养并纯化了SD大鼠HERS细胞。结果发现:本实验分离的牙胚颈部组织仅包含牙乳头、HERS和牙囊三种组织;原代培养细胞为混杂细胞,包括成纤维样细胞和上皮样细胞;经3次差别消化和角质细胞无血清培养液连续培养,成纤维样细胞被完全去除,剩余的贴壁细胞全部为上皮样细胞;免疫细胞化学实验证实上皮样细胞为上皮来源细胞,RT-PCR检测显示纯化的上皮细胞中无间充质细胞混杂。结果表明:我们获得了纯化的HERS细胞,为进一步研究HERS细胞的生物学特性奠定了基础。实验二、通过扫描电镜观察、MTT检测和RT-PCR等方法对HERS细胞的一些生物学特性进行了初步研究。结果发现:HERS细胞表面有发达的微绒毛和细胞连接;HERS细胞生长增殖较牙胚间充质细胞缓慢;在矿化诱导条件下,HERS细胞可形成钙盐沉积;HERS细胞与成釉器细胞有所不同,除表达AMBN和OCN外不表达其它牙齿矿化相关蛋白。结果表明:HERS细胞呈现典型上皮细胞表面结构特征;HERS细胞虽来源于成釉器,但与成釉器细胞有所不同。第三部分HERS细胞和牙胚颈部间充质细胞的相互作用实验一、分别收集HERS细胞和牙胚颈部间充质细胞的条件培养液(conditioned media, CM),用于互相培养,MTT法测定生长曲线,观察两种细胞在生长增殖方面的相互作用。结果发现:用HERS细胞的CM培养时,牙胚颈部间充质细胞的生长增殖无明显变化;反之,用牙胚颈部间充质细胞的CM培养时,HERS细胞生长增殖明显加快。结果表明:HERS细胞对牙胚颈部间充质细胞的生长增殖无明显作用,反之,牙胚颈部间充质细胞可促进HERS细胞的生长增殖。另外,本实验成功建立了研究HERS和牙胚间充质相互作用的实验模型。实验二、通过ALP活性检测、RT-PCR和细胞团体内种植方法,分析HERS细胞CM培养对牙胚颈部间充质细胞分化的作用。结果发现:HERS细胞CM作用于牙胚颈部间充质细胞,可使其ALP活性提高,DSPP、DMP1、BSP、OPN、OCN和ALP mRNA表达增加,并且使其在体内分化的成牙本质细胞和形成的管状牙本质增多。结果表明:HERS可促进牙胚颈部间充质细胞的分化。第四部分HERS在牙胚和牙胚颈部组织的体内种植和体外培养中作用的研究实验一、将PN7-8d的SD大鼠下颌第一磨牙完整牙胚植入母鼠肾被膜下,大网膜和皮下,4周后对种植牙胚进行组织学观察。结果发现:植入的牙胚能够在体内种植部位发育出结构较完整和形态较好的牙根和牙周组织,而且没有明显的免疫排斥和炎症反应。结果表明:牙根可以在体内异位环境下继续发育,其关键可能在于选择体内种植牙胚的发育时机,即牙根发育已启动的时机;HERS在牙根发育中起着重要作用,是牙根发育不可或缺的组织;利用母鼠体内环境培养仔鼠牙胚组织,是研究牙齿发育和培养组织工程牙齿的理想动物模型。实验二、PN7-8d的SD大鼠下颌第一磨牙牙胚被分切成冠部和颈部两部分,分别通过流式细胞术测定细胞周期,并分别植入母鼠肾被膜下。结果发现:绝大多数牙胚颈部细胞处于G0G1期,而许多牙胚冠部细胞进入S期和G2期;牙胚颈部组织在肾被膜下发育出结构较完整和形态较好的牙根和牙周组织,而牙胚冠部则无此类发育现象。结果表明:PN7-8d的SD仔鼠下颌第一磨牙牙胚的颈部组织处于牙根发育前的准备期;牙根发育的基本组织是包括HERS在内的牙胚颈部组织。实验三、体外立体培养PN7-8d的大鼠仔鼠下颌第一磨牙牙胚,观察牙胚发育情况。结果发现:体外培养12d时,牙胚体积和结构基本维持不变,但随后牙胚发生萎缩;整个体外培养过程中,未见到牙胚继续发育牙根。结果表明:本实验成功构建了出生后牙胚的体外立体培养模型,但可能由于牙根发育调控因素的复杂性,未能使牙胚在体外继续发育牙根。实验四、使用不同的酶消化方法,将HERS离散为单个细胞或碎片,并和牙乳头细胞、牙囊细胞一起离心形成细胞团,细胞团在体外培养4h后植入母鼠肾被膜下,4周后观察组织发育情况。结果发现:含有HERS碎片的细胞团形成了牙根和牙周组织样结构,含有离散HERS细胞的细胞团仅形成了管状牙本质。结果表明:HERS的双层上皮结构对引导正常牙根的发育具有重要作用,失去结构的HERS引导牙根生成的能力是有限的。实验五、切取PN25d的SD大鼠的根端组织,植入母鼠肾被膜下,4周后观察发育情况。结果发现:SD大鼠牙根根端组织在肾被膜下可发育出牙齿根尖样的组织结构。结果表明:PN25d的SD大鼠磨牙根端组织仍具有形成牙根和牙周组织的能力,但可能由于其自身含有的HERS减少,其发育牙根和牙周组织的能力有所下降。