中医传统理论认为大豆性平味甘、健脾宽中、清热解毒,对虚劳内伤、微热伤寒等疾病有一定疗效,且具有较高的营养价值。然而大豆可引起人体过敏反应,过敏也是中药不良反应及其临床安全用药关注的重点之一。大豆过敏原蛋白大多为糖蛋白,已有研究表明糖链可能是引起过敏反应的抗原决定簇。目前,对于大豆过敏研究多集中在蛋白质部分,而对大豆过敏原蛋白糖基化及其糖链结构研究报道较少,糖基化对蛋白质功能和结构有着重要的影响。因此,研究大豆蛋白糖链结构与功能,对大豆致敏机制研究有着重要现实意义,也可为大豆资源深入开发利用和中药学研究拓展奠定基础。本文以大豆种子为研究对象,深入分析大豆过敏原糖蛋白的糖链结构、糖基化位点及其致敏性,并研究糖链在大豆蛋白质致敏过程中的作用,以期为大豆致敏机制研究提供参考。所取得的主要研究结果如下:1.分析了大豆中各种糖蛋白N-糖链的结构与数量分布。利用SDS-PAGE凝胶分离大豆蛋白,将所得蛋白条带回收并用于N-糖链的释放和标记,最终以ESI-MS、MS/MS和在线LC-UV-MS/MS2对糖链进行定性定量分析。结果表明,在所得到的15个大豆蛋白SDS-PAGE条带中,有2种蛋白主要含有可能与大豆过敏相关的核心α1,3-岩藻糖基化N-糖链,7种蛋白主要含有高甘露糖型N-糖链,6种蛋白未被糖基化。本研究首次发现γ-伴大豆球蛋白(γ-conglycinin)、蔗糖结合蛋白(sucrose binding protein)、β-淀粉酶(β-amylase)和 β-伴大豆球蛋白亚基片段(β-conglycinin subunit fragment)都具有N-糖基化现象,并首次发现β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)的α’、α和β亚基中均含有可能与大豆过敏相关的核心α1,3-岩藻糖基化N-糖链。2.定性定量比较分析了成熟大豆和未成熟大豆N-糖链的差异。分别采用化学法同时释放和标记这两种大豆样品的总蛋白和7S球蛋白N-糖链,然后以ESI-MS、MS/MS和在线LC-UV-MS/MS2进行定性定量比较分析。结果表明,两种样品总蛋白均含有 7 种 糖链,分别为:H3N2X1、H3N2X1F1、H5N2、H6N2、H7N2、H8N2、H9N2,并且都不含同分异构体;两种样品的7S球蛋白均含有6种N-糖链,分别为:H3N2X1、H3N2X1F1、H5N2、H6N2、H7N2、H8N2,且都不含同分异构体;成熟大豆总蛋白和7S球蛋白中含有的β1,2-木糖修饰和α1,3-岩藻糖修饰的N-糖链明显高于未成熟大豆。3.详细分析了大豆过敏原糖蛋白β-conglycinin和Gly m bd 30K的N-糖基化位点。利用Trypsin和Pepsin酶对其进行水解,以Con A亲和层析柱富集纯化糖肽,并用PNGase F和Endo H分别酶解糖肽,采用电喷雾质谱(ESI-MS)和串联质谱(MS/MS)对所得肽段的氨基酸序列及糖链结构进行分析,最后通过数据库检索对分析结果进行验证。结果表明,β-conglycinin具有5个N-糖基化位点,分别为α亚基的199和455位Asn、α’亚基的215和489位Asn和β亚基的326位Asn,且每个糖基化位点均被H5N2、H6N2、H7N2、H8N2这4种高甘露糖型N-糖链所修饰。GlymBd30K只含有1个糖基化位点,位于170位Asn,被H3N2F1X1和H3N2X1这两种复杂型N-糖链所修饰。本研究为各种糖蛋白糖基化位点及其糖链结构的鉴定分析提供方法参考,也为深入理解大豆糖蛋白抗原表位的特异性以及致敏机理提供依据。4.比较了成熟大豆与未成熟大豆7S球蛋白的致敏性。以大豆7S球蛋白为研究对象,分别以成熟大豆7S球蛋白和未成熟大豆7S球蛋白样品建立Balb/c小鼠主动全身过敏实验模型,并比较各组实验小鼠IgE和组胺的表达水平;同时,建立被动皮肤过敏试验测定蛋白样品的特异性IgE抗体滴度。结果显示,成熟大豆7S球蛋白致敏小鼠中IgE和组胺的表达水平显著高于未成熟大豆7S球蛋白,且特异性IgE抗体滴度也高于未成熟大豆7S球蛋白,表明了成熟大豆7S球蛋白的致敏性高于未成熟大豆7S球蛋白。5.对大豆7S球蛋白N-糖链在大豆过敏中的作用进行了分析研究。分别以成熟大豆7S球蛋白和去糖基7S球蛋白建立Balb/c小鼠主动全身过敏实验动物模型,然后以这两种蛋白分别对小鼠模型进行大剂量处理,并对小鼠血清中IgE抗体和组胺进行定量分析。结果显示,成熟大豆7S球蛋白致敏小鼠血清中IgE抗体和组胺的含量显著高于去糖基7S球蛋白致敏的小鼠(P<0.05,P<0.01),表明了N-糖链在7S球蛋白致敏过程中具有增强作用。