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纤维素是地球上分布范围广泛、含量丰富的天然高分子多糖类物质。它的高效利用可以解决资源枯竭、环境污染等重大问题。纤维素酶是多组分酶,其中β-葡萄糖苷酶是降解纤维素的关键限速酶。本研究以嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）为实验材料,对糖苷水解酶第三家族β-葡萄糖苷酶活性通道内的非保守氨基酸以及酶催化中心可能与底物结合的保守氨基酸进行了定点突变,研究突变酶的酶学性质,筛选出了酶与底物结合的关键氨基酸位点及热稳定性强的突变酶。主要研究结果如下:克隆了来自嗜热毛壳菌糖苷水解酶第三家族β-葡萄糖苷酶的基因bgl3,将其导入毕赤酵母中表达,对表达的蛋白进行分离和纯化。SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化产物,蛋白大小为120kDa,比预测的理论分子量大,说明蛋白翻译过程中发生了糖基化的修饰,得到野生酶BGL3。BGL3的比活力为36.1U/mg,酶促反应最适温度和pH值分别为60℃和5.0。Km、kcat、kcat/Km值为4.27±0.032mM、20.16±0.13s-1、4.72±0.061s-1×mM-1。野生酶在60℃和70℃保温10min,分别保持65.6%和7.0%的酶活力。为了获得性质良好的突变酶,对酶活性通道里的8个非保守氨基酸G148、N187、A236、M267、Q273、M288、W438和R508进行了定点突变,得到突变酶G148A、N187Y、A236S、M267Q、Q273H、M288A、W438G和R508M。以4mM的水杨苷为底物,测定突变酶的酶学性质。与BGL3相比,突变酶N187Y的Km值降低,其它突变酶的Km值升高;R508M的kcat值升高,其它突变酶的kcat值降低;8个突变酶反应最适温度均为60℃;A236S反应的最适pH为4.0,其它突变酶反应的最适pH为5.0;突变酶W438G和M288A在70℃保温10min后分别保持30.9%和62.2%的相对酶活力。为了筛选酶与底物结合的关键氨基酸位点,对BGL3进行同源建模,将11个可能与底物结合的氨基酸位点突变为丙氨酸A,得到突变酶V67A、D85A、R91A、L134A、R149A、K182A、H183A、R193A、M234A、Y237A和W270A。以4mM水杨苷为底物,测定突变酶的酶学性质。与BGL3相比,突变酶R149A、K182A和M234A酶活力完全丧失,其它突变酶的酶活力也都有不同程度的降低;11个突变酶最适反应温度和pH分别为60℃和5.0;突变酶V67A和Y237A的kcat升高,其它的突变酶kcat降低。V67A、D85A和Y237A的Km值升高。本实验筛选出了酶与底物结合的关键氨基酸位点,为糖苷水解酶第三家族β-葡萄糖苷酶的进一步分子改造提供参考。