家蚕Perilipin-like蛋白的原核表达及功能研究

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Perilipin蛋白是脂滴相关蛋白家族的核心成员之一,是定位于脂滴表面的高磷酸化的蛋白,对脂肪组织中甘油三酯的代谢有双重调节作用,既可通过阻止脂肪酶接近脂滴降低基础状态下的脂解,又可促进激素刺激的脂肪分解。Perilipin蛋白在脂代谢中发挥重要作用,其表达调控可能与肥胖及其相关代谢疾病如糖尿病、胰岛素抵抗等有重要关系。从本实验室获得一条cDNA,开放阅读框序列长度为918bp的基因,预测其编码的蛋白有305个氨基酸残基,相对分子量32.497kDa,经NCBI比对发现,预测编码的蛋白具有perilipin保守结构域,将其命名为BmPLIN。将此基因插入到融合表达载体pET-28a(+)的多克隆位点,经PCR,双酶切鉴定重组质粒构建成功后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta中,IPTG终浓度0 mM,37℃表达成功,表达的重组蛋白都以包涵体形式存在。经过溶解液洗涤,将含有目的蛋白的上清经镍柱亲和层析和反相柱层析纯化后,以纯化的重组蛋白为抗原免疫大白兔获得该蛋白的多克隆抗体,经ELISA检测,抗体效价可达1:12800以上。提取家蚕各个时期和组织的天然蛋白和总RNA,利用荧光定量PCR技术以及荧光Wester.blotting技术,分析BmPLIN基因在家蚕发育过程中不同时期及五龄幼虫各组织中的转录、表达情况。结果显示该基因mRNA在家蚕发育各时期的表达量由高到低依次为蛹、幼虫、卵、蛾,而在五龄幼虫各组织中,性腺中检测到BmPLIN蛋白的表达。同时,以该抗体联合免疫荧光标记对家蚕Bm5细胞进行亚细胞定位,发现BmPLIN蛋白在细胞质和细胞核内均有分布。
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