【目的】　　因创伤、炎症、退变等原因导致的软骨损伤和缺损在临床上十分常见。由于软骨细胞是终末分化细胞,而且软骨组织无直接的血液供应和神经支配,软骨损伤后自身修复能力非常有限。运用组织工程技术制备的仿生人工软骨给治愈软骨损伤带来了希望,但当前大多存在种子细胞来源有限、供区受损,支架材料力学强度不够、生物兼容性及降解率欠佳等缺点。寻找对供区无损害且来源广泛的种子细胞,满足一定强度要求、操作相对简单、效果理想的组织工程化软骨正成为目前急需解决的重要问题。本实验将取第三代兔骨髓间充质干细胞,与Nano-HA/PLLA复合后在软骨诱导培养液中诱导培养2周,自体移植修复膝关节股骨髁部软骨缺损,同时设支架对照组和空白对照组。分别于移植术后12W、24W取材,进行大体观察和组织学检测,为软骨损伤以达到治愈奠定实验基础。　　【方法】　　1.取2～3月龄一健康新西兰大白兔,体重2.0-3.0kg,无菌条件下用18号骨髓穿刺针从股骨外髁穿刺抽取骨髓3～5mL,应用Percoll(1.073g/ml)分离液分离培养骨髓中兔骨髓间充质干细胞,培养、传至第3代,同时观察细胞增殖情况。取第3代MSCs种植于Nano-HA/PLLA支架体外复合培养。　　2.将18只新西兰兔制备双侧膝关节全层软骨缺损模型,直径4.5mm,深度5mm。根据修复方法不同随机分为A、B、C3组(n=6)。取第三代骨髓间充质干细胞与Nano-HA/PLLA复合后在软骨诱导培养液中诱导培养2周,自体移植修复膝关节股骨髁部软骨缺损。A组(实验组):将MSCs与Nano-HA/PLLA支架材料复合物植入兔双膝缺损处;B组:将单纯Nano-HA/PLLA支架材料植入兔双膝缺损处;C组:缺损处不作任何处理,作为空白对照。　　3.分别于术后12周和24周,取材行大体、组织学及免疫组织化学染色观察,并将修复标本按照Wakitani法组织学评分进行评分。　　【结果】　　1.原代及传代rBMSCs均表现为长梭、纺锤形改变,呈放射状、涡旋状排列,复合培养7d后,扫描电镜见载体表面不规则,其间可见部分微孔被细胞充填,伸展良好;复合14d后,细胞在材料空隙中粘附良好,密集处连接成片,细胞充填率达60％。　　2.大体观察:术后24周,A组修复组织与正常软骨结合处完整,表面光滑,界限模糊;B、C组缺损处修复组织呈纤维组织或无修复,表面不平整或呈虫蚀样改变。　　3.组织学观察:A组:12周的样本HE染色显示细胞数较多,但缺乏典型软骨细胞的带状排列,可见多孔支架结构,缺损表面有类软骨特征的组织。番红O染色移植区有硫酸糖胺聚糖异染。24周的样本表面光滑,类软骨组织增多,番红O染色强阳性,底部形成规则的软骨下骨,软骨层与骨层形成一道钙化的界面。B组:12周的样本相对光滑的纤维组织,无软骨层,支架多孔存在,HE染色见圆形的细胞,番红O染色未见移植区有硫酸糖胺聚糖异染,24周时染色也未见软骨层,番红O也未显示软骨细胞形成。C组:12周的样本有不规则和纤维的表面,24周的样本显示,纤维细丝在缺损中占主导,缺损没有完全填充同时没有软骨层形成。　　4.免疫组织化学染色:A组:12周时Ⅱ型胶原蛋白是整个移植区不同软骨细胞分泌的,表面整个修复的组织被染色,局部还有密集的染色区。24周时番O染色和免疫染色显示sGAG和Ⅱ型胶原蛋白的同一的分布,和正常软骨相似。B、C组:缺损处几乎既没有含有sGAG的大片软骨组织也没有Ⅱ型胶原蛋白沉积。　　5.Wakitani法组织学评分:同一时间点A组评分明显优于B、C组,有统计学意义,(P<0.05);B组与C组评分无统计学意义,(P>0.05)。　　【结论】　　1.rBMSCs细胞取材方便,采用密度梯度离心法能分离获得大量实验用rBMSCs。rBMSCs培养性能稳定,便于传代扩增;而且rBMSCs具有多向分化性,在一定诱导条件下可转化为成软骨细胞,适合于作为软骨组织工程的种子细胞。　　2.以rBMSCs为种子细胞、纳米羟基磷灰石/左旋聚乳酸为支架材料构建的组织工程软骨可作为软骨缺损的移植材料,能较好的修复兔膝关节软骨缺损。