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目的急性肝衰竭(acute hepatic failure, AHF)是由多种因素引起的肝细胞严重损害,导致肝脏的合成、代谢、转运和排泄等功能发生严重障碍,继而出现以严重消化系统症状、极度乏力、深度黄疸、凝血功能障碍、肝性脑病和腹水等为主要表现的临床综合征,最终可出现多器官功能衰竭和死亡。AHF来势凶猛,发展迅速,预后很差,死亡率高达70%-80%,是严重危害人类健康的一种疾病。在西医基础综合治疗基本相同的情况下,加用中药保护患者残存的肝细胞和促进其肝脏的再生,提高患者的存活率,就显得尤为重要。由于AHF的症候变化多端,病机错综复杂,给临床的辨证论治带来了诸多困难。但我们认为,急性肝衰竭属于肝脏疾病的极期阶段,其主要的病因病机为“毒瘀胶结,正气衰竭”,中医治疗应以祛邪为主,兼以扶正。AHF属于中医“急黄”“鼓胀”“血证”“肝厥”等范畴,目前对AHF的治疗尚缺乏疗效显著的药物,我们根据南方医院广东省中西医结合肝病重点专科长期的临床经验总结,自拟三黄茵赤汤进行实验研究。本实验通过建立D-氨基半乳糖(D-GalN)联合脂多糖(LPS)诱导的大鼠急性肝衰竭模型,观察三黄茵赤汤对AHF大鼠肝脏内的超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)和Caspase3的影响,从而探讨其是否通过抗氧化应激抑制凋亡蛋白而达到防治急性肝衰竭的作用,为中医药治疗AHF提供一定的科学理论依据。方法1.实验药物三黄茵赤汤药物组成：大黄、姜黄、黄芪、茵陈蒿、赤芍。2.实验动物与分组48只SPF级雄性SD大鼠,体重200～220g,随机分为正常对照组、模型组、三黄茵赤汤高、中、低剂量组、双环醇组,每组8只。3.造模大鼠在SPF级条件下适应性饲养1周,1周后预先连续灌胃5天,之后开始造模,造模前禁食12h,不禁水,正常对照组腹腔注射等渗生理盐水,模型组、三黄茵赤汤高、中、低剂量组、双环醇组腹腔注射10μg/kgLPS,半小时后,腹腔注射700mg/kg的D-GalN。造模后治疗组继续灌胃治疗,提供正常饮食。48h后戊巴比妥钠400mg/kg麻醉大鼠,腹主动脉采血,离心,分离血清置-80℃保存,取肝组织,部分浸泡于4%多聚甲醛,部分置于-80℃保存。4.观察及检测指标采用全自动生化检测仪检测各组大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)的含量；采用全自动凝血检测仪检测各组大鼠凝血酶原时间(PT)、国际标准比率(INR)、血浆纤维蛋白原(FIB)的水平；利用Nikon Eoipse Ti-s倒置显微镜观察大鼠肝脏病理形态学变化；采用总超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)检测试剂盒和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)检测试剂盒检测肝脏组织匀浆液中SOD、MDA的含量；免疫组化法检测肝脏中caspase3原位表达情况；采用蛋白质免疫印迹(Western blot)检测肝脏中caspase3的相对表达水平。5.统计学方法数据用SPSS13.0软件进行统计学分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,多样本均数的比较采用One-Way ANOVA方差分析,组间多重比较若符合方差齐性检验时用Tukey法,若不符合则用Dunnett’ T3法,计数资料及率的比较用卡方检验。以P<0.05均为有统计学意义。结果1.肝功能检测结果与模型组相比,三黄茵赤汤高、中、低剂量组和双环醇组均能降低大鼠血清中ALT、AST以及TBIL的含量,有显著性差异(P<0.01),三黄茵赤汤高剂量组与双环醇组相当(P>0.05)；中、低剂量组不如双环醇组,亦有统计学差异(P0.05)。2.凝血功能检测结果与模型组相比,三黄茵赤汤高、中、低剂量组、双环醇组均能缩短大鼠血清中PT、INR时间和增加FIB的含量,有显著性差异(P<0.01),三黄茵赤汤高剂量组与双环醇组相当(P>0.05)；中、低剂量组不如双环醇组,亦有统计学差异(P<0.05)。3.肝脏病理形态观察各组大鼠苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining, HE染色)的结果显示,正常对照组肝小叶结构清晰,肝细胞排列规则有序；模型组肝细胞成大块、亚大块坏死,肝索紊乱,小叶结构模糊不清,肝窦明显扩张充血并出血,小叶内及汇管区炎性细胞浸润,残存肝细胞水肿变性；给药各组均有改善作用,肿胀减轻,坏死减少,高剂量组与双环醇组相当,中、低剂量组不如双环醇组。4.肝脏组织匀浆液中SOD、MDA的检测结果结果显示三黄茵赤汤高、中、低剂量组、双环醇组均能提高大鼠肝脏组织匀浆液中SOD的活性(P<0.01)减少MDA的含量(P<0.01),三黄茵赤汤高剂量组与双环醇组相当(P<0.05)；中、低剂量组不如双环醇组,亦有统计学差异(P<0.05)。5. caspase3原位表达的结果免疫组化结果显示,caspase3主要在肝细胞胞浆中表达为主,三黄茵赤汤不同剂量组均能减低caspase3的表达水平(P<0.05),三黄茵赤汤高剂量组与双环醇组相当(P>0.05)；中、低剂量组不如双环醇组,亦有统计学差异(P0.05)。6.三黄茵赤汤不同剂量对caspase3蛋白表达的影响Western blot分析显示,三黄茵赤汤不同剂量组均能减低caspase3的表达水平(P0.01),三黄茵赤汤高剂量组与双环醇组相当(P>0.05)；中、低剂量组不如双环醇组,亦有统计学差异(P<0.05)。结论1.三黄茵赤汤具有改善肝脏功能、凝血功能的作用。2.三黄茵赤汤能提高肝脏中SOD的活性,降低MDA的含量,减少caspase3的表达,抑制肝细胞的凋亡。3.三黄茵赤汤具有防治急性肝衰竭的作用,其可能的机制是通过抗氧化应激从而抑制caspase3的表达,减少肝细胞的凋亡。