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流行性日本乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)是由日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一种以蚊子为主要传播媒介的人畜共患的自然疫源性疾病。JEV具有神经毒性能造成人的神经系统疾患，发生十分严重的后果，对猪则造成母猪死胎、木乃伊胎、流产，公猪睾丸炎等繁殖障碍性疾病。虽然本病对猪的致死率不高，但能够严重损害养猪业的经济利益，是养猪业最重要的繁殖障碍性疾病之一。蚊子是乙型脑炎流行主要的传播媒介，而猪则是JEV最重要的增殖宿主和储存宿主。本研究从河南规模化种猪场中采集19例疑似乙型脑炎病例的公猪精液样本进行JEV的分离鉴定及分子进化分析，旨在深入研究乙型脑炎在河南省规模化种猪场的流行病学情况，对有效控制猪群乙型脑炎的大规模流行提供科学依据。
本研究首先参考GenBank中已报道的JEV M、E基因序列，利用DNAstar5.0软件进行同源性分析并找出保守序列，用Primer Premier5.0软件设计2对特异针对JEVE基因和M基因的引物。采用RT-PCR方法对采集的精液样品进行初步鉴定，提取采集的疑似乙型脑炎病例的材料的总RNA为模板进行RT反应，应用设计的特异引物对JEV M、E基因进行PCR扩增，最终从19份猪精液样品中成功分离出2株JEV。乳鼠攻毒实验表明，用种猪精液上清经脑内接种3日龄乳鼠，接种72h后发病鼠出现四肢僵硬、头向一侧扭曲等典型神经症状。对攻毒乳鼠脑组织进行RT-PCR扩增JEV的M和E基因，结果试验鼠和阳性对照均扩增出与预期大小相符的2种PCR产物，阴性对照小鼠则无条带。测序结果表明这2种PCR产物分别为JEV M或E基因，与之前测序结果完全一致，这表明本实验从种猪精液中成功分离到的2个JEV毒株，将其分别命名为BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3。
用BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3攻毒乳鼠脑组织毒接种BHK-21细胞，于接毒后60 h用抗JEV E蛋白单抗进行间接免疫荧光鉴定。结果显示，2个毒株感染后的BHK-21细胞中均超过半数细胞的胞浆内呈现明显的特异性荧光染色，而阴性对照细胞则无荧光，进一步证实本实验分离的毒株为JEV毒株。用BHK-21细胞对新分离毒株进行体外培养，感染72 h后分别取样进行病毒效价测定。结果显示，BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3的第1代细胞培养物的病毒效价均较低，分别为103.2±0.2 TCID50/mL和101.6±0.1 TCID50/mL，随后继续传代病毒量均获得明显增加，最高病毒量分别可达104.5±0.1TCID50/mL和104.2±0.2TCID50/mL。
本研究最后对新分离的JEV毒株进行基因进化树的构建及分析，采用国外及国内分离到的SA14、SA14-14-2、Ha-3等共计17株，属于4种不同基因亚型的JEV分离株的M和E基因为参考序列分别构建JEV M基因和E基因进化树，对新分离的2株JEV进行遗传进化分析。结果表明，19个JEV毒株分别分布于4种不同的进化分支，新分离的BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3毒株与国内分离株SA14、SH-3、Ha-3、以及疫苗株SA14-14-2在M基因进化树和E基因进化树中均位于基因Ⅲ型的分支，并且新分离的这2个毒株与疫苗株SA14-14-2亲缘关系最近。