Hedgehog信号通路作为从果蝇到哺乳动物进化上高度保守且与发育相关的通路之一,在成体组织稳态维持和组织修复方面发挥着必不可少的作用,而它的异常变化与人类多种肿瘤疾病相关。自从果蝇中发现Hedgehog基因后,脊椎动物中的Hh同源基因也相继被发现。Hh在进化上高度保守,主要由HhC和HhN两个结构域组成,其中,HhC结构域催化Hh蛋白前体裂解并激活Hh蛋白活性,而HhN行使信号转导的功能。Hh分泌蛋白配体家族作为多细胞生物中细胞命运选择的主要调控者,在胚胎发育和胚胎后组织稳态的器官形成中发挥着重要的作用。广泛分布的Hh蛋白是通过剂量依赖的方式进入细胞使其产生不同的细胞命运。现在研究表明,HH信号通路通过参与肠道干细胞增殖来维持肠道稳态和组织再生,然而,家蚕中肠中关于该基因的功能还鲜有报道。家蚕作为鳞翅目昆虫的重要代表,具有重大的经济价值。肠道作为家蚕第二大器官,在其完全变态发育过程中也不断进行着组织重构、退化和再生。为了了解Hedgehog配体蛋白在家蚕中肠稳态维持和组织修复中可能的调控作用,本研究基于生物信息学研究方法,鉴定克隆了家蚕BmHh基因并对其基因序列信息进行分析,进一步对其在家蚕中肠中功能进行了初步探索,获得以下研究成果:1、家蚕BmHh基因序列信息分析以NCBI和家蚕基因组等数据库为基础,通过生物信息学分析鉴定得到了家蚕BmHh基因,采用PCR和RACE等技术获得了家蚕BmHh基因全长序列,进一步分析显示,该基因定位于9号染色体,含有5个外显子和4个内含子,全长为3172bp,CDS为1149bp,编码383aa,预测蛋白分子量42.37kDa,具有两个典型的HhN和HhC蛋白结构域。通过各物种间Hh基因多重序列比对及系统进化树分析发现该基因在进化上比较保守。2、家蚕BmHh表达特征分析及其亚细胞定位采用实时荧光定量PCR技术对BmHh的表达特征进行了分析,结果显示,BmHh在家蚕五龄三天各组织中均有表达,推测HH通路广泛存在家蚕各组织中;进一步检测BmHh在家蚕幼虫中肠不同时期中的表达情况,发现该基因在家蚕幼虫各时期的蜕皮前期表达量较高,推测在蜕皮前期肠道开始进行组织重构,细胞分裂活动较旺盛,BmHh可能参与家蚕中肠肠道干细胞的增殖及分化形成成熟肠细胞。通过生物信息学分析发现家蚕BmHh蛋白具有信号肽,是一种分泌蛋白。进一步构建该基因过表达载体并转染家蚕卵巢细胞系,发现BmHh蛋白主要分布在细胞核附近的细胞质中,推测家蚕BmHh蛋白也存在相似的蛋白加工修饰过程。3、家蚕BmHh蛋白抗体制备及特异性检测基于家蚕基因组数据库,并结合生物信息学分析,从BmHh编码框中选取一个756bp的特异性片段,设计引物PCR扩增后连接到PET-32a(+)上成功构建原核表达重组质粒。采用最适温度和IPTG浓度诱导获得重组蛋白,进一步蛋白纯化后注射小鼠获得免疫血清,ELISA检测效价为1:16000,即成功获得了BmHh蛋白多克隆抗体。收集家蚕卵巢细胞系分别通过Western blot和免疫荧光对抗体特异性检测,结果表明制备的BmHh蛋白多克隆抗体有效,可用于下一步实验。4、家蚕BmHh在家蚕卵巢细胞系和中肠中的功能初探家蚕卵巢细胞系中分别添加BmHh的RNA干涉双链和HH通路抑制剂环靶明后,qRT-PCR检测发现HH通路主要基因Hh、Ptc、Smo和Ci基因表达均下调,BrdU免疫荧光检测发现细胞增殖水平均显著降低。同样的,家蚕注射抑制剂环耙明后中肠中也得到相同的结果,推测BmHh及HH信号通路参与家蚕中肠细胞的增殖。通过添食E.Coli、Bt和Bleomycin来刺激肠道后,qRT-PCR和Western blot检测发现家蚕BmHh表达上升,进一步BrdU免疫荧光检测发现肠道增殖水平显著升高,推测家蚕BmHh参与肠道干细胞的增殖分化来应对病原体和药物引起的肠道损伤,最终使肠道稳态得以维持。