论文部分内容阅读
转化生长因子β(TGF-β)是TGF-β蛋白超家族中的一员,主要由巨噬细胞、成纤维细胞和血小板产生,参与调节多种细胞功能,例如细胞增殖、分化、存活、迁移和免疫细胞的活化和失活等。进化研究表明,TGF-β基因似乎相当保守,其配体、受体和与家族蛋白有关的信号分子在节肢动物中也存在,表明该基因在十亿年前就已存在。在哺乳类动物中发现TGF-β有3种异构体:TGF-β1、2、3,其中TGF-β1在所有免疫细胞中都有所表达,并在出现各种压力和多种疾病信号后,参与细胞反应。在免疫系统中,成熟的TGF-β1多肽是一种强有力的细胞分化调节剂和免疫调节剂,并能下调许多细胞因子的表达。
本文利用同源克隆和RACE方法从健康大海马肾脏组织中克隆得到了TGF-β1全长cDNA序列,序列全长为1941bp,5非编码区为210 bp,3非编码区为570 bp,ORF为1161 bp。其中ORF序列编码一段含386个氨基酸的前体蛋白,包括含信号肽的前导肽和含112个氨基酸的成熟肽。在推导的大海马TGF-β1氨基酸序列里具有特征性标志成熟肽起始的KEX-Furin样蛋白酶识别位点(RKRR)。氨基酸序列比对发现,大海马TGF-β1成熟肽中有由9个半胱氨酸组成的具有TGF-β1基因结构特征标志的“cysteine knot”结构以及保守的成熟肽36位点的脯氨酸和46位点的甘氨酸。同源性分析发现,大海马TGF-β1和斜带石斑鱼TGF-β1的同源性很高,达到79％,与哺乳类的同源性较低。邻近法构建的家族进化树结构表明,大海马TGF-β1和其他鱼类TGF-β1进化树在同一分支上,且与已报道的鲈形总目鱼类TGF-β1具有很近的亲缘关系。利用半定量PCR和Realtime PCR技术,分析了TGF-β1基因在健康大海马各组织中的表达情况。结果显示,TGF-β1 mRNA在健康大海马肾脏中表达最高,其次是肝脏、端脑、小脑、皮肤、中脑、卵巢,在鳃和肠道中表达很少,在心脏和肌肉中检测不到表达。TGF-β1基因在大海马外周组织和脑部组织中均能检测到表达,这些证据表明,TGF-β1可能参与大海马体内局部以及全身的信号传递。为了进一步研究大海马TGF-β1的生物学功能,我们利用pET22b(+)质粒构建了表达大海马TGF-β1成熟肽的重组质粒,并利用TNT(R)快速偶联的转录/翻译系统对重组蛋白进行表达,获得了较高浓度的可溶性单体蛋白,用双琥珀酰亚胺辛二酸酯磺酸钠盐(BS3)交联后形成了大量的可溶性二聚体蛋白。然后利用得到的大海马TGF-β1重组蛋白刺激人宫颈癌HeLa细胞,并对细胞中TGF-β1介导的Smad信号通路中的Smad3,Smad4,Smad7下游因子的表达情况进行了检测。结果表明,刺激细胞中Smad3,Smad4基因表达量上升,Smad7基因表达量下降,大海马rTGF-β1能够诱导人细胞中Smad信号通路的活化,具有特定的生物学活性,延续了TGF-β1蛋白功能的保守性。