研究背景脓毒症是有多种感染因素引发的,以全身性炎症反应为主的一类严重综合征。脓毒症、脓毒症休克是导致危重症病人死亡的一个重要因素。近几年对脓毒症的生理病理机制,以及临床的诊断治疗都有很多相关的探讨。然而脓毒症的患病率和病死率仍然是非常高。大量文献报道氧化应激对脓毒症的发生、发展进程存在重大影响。乌司他丁(UTI)是一类蛋白酶抑制剂(尿液中提取),可以抑制多种蛋白和水解酶的活性,具有抗氧化、抗炎、抗凋亡及信号调节作用。前期临床试验发现这些药物能改善脓毒症病人的治疗效果,但其作用尚不明确。目的评估UTI对脓毒症病患的治疗效果,并通过检测受试者血清中氧化物质的浓度的改变来研究其中的作用机制,在细胞水平进一步探究UTI对脂多糖内毒素(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的保护作用及其分子作用原理。研究方法(1)将40例符合脓毒症的诊断标准的纳入者,严格按照随机化分配原则归为对照组(n=20),乌司他丁组(n=20)。并选取10名正常体检者,为本次实验的正常组的纳入者。对照组给予的治疗严格按照脓毒症的诊疗规范,乌司他丁组除了采用对照组的基础治疗外另给予静脉注射乌司他丁10万U q8h,连用7天。在治疗前和治疗后的第4、8天抽取静脉血,用来检测血清中的氧化产物丙二醛(MDA),以及用来检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化物质的变化。正常组在体检时抽得静脉血,检测结果作为本实验的正常组。常规监测患者的T(体温)、RR(心率)、PR(呼吸频率)、WBC(白细胞计数),并统计患者机械通气的时间,在ICU的住院时间,以及患者的28d生存率。(2)在临床研究的基础上,利用脂多糖诱导体外人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical VeinEndothlial Cells, HUVECs),构建氧化应激损伤模型,根据脂多糖的浓度梯度实验和时间梯度实验,分别选择10μg/ml的药物浓度,24h的处理时间定为制作HUVEC氧化应激模型的实验浓度和实验时间,针对乌司他丁保护作用的浓度梯度实验选取100U/ml的浓度当作实验的有效作用浓度。细胞实验分为空白对照组、UTI组、LPS组、UTI+LPS组、SP600125+LPS组,UTI+Y60025+LPS组。细胞的存活率的检测选择一种常用的方法(MTT方法), MDA、GSH-Px试剂盒检测MDA、GSH-Px的产生,用Western blot的方法检测SOD、JNK、p-JNK、 c-Jun、p-c-Jun等蛋白的表达,进一步探讨UTI对LPS诱导的HUVECs损伤是否存在有效的保护作用。应用LPS诱发血管内皮细胞损伤,探讨UTI通过JNK/c-Jun信号转导通路来对抗氧化应激。结果(1)乌司他丁组患者的RR(心率)、PR(呼吸频率)、T(体温)、WBC(白细胞计数)、PCT(降钙素原)、CRP(C反应蛋白)、Lac(乳酸水平)治疗后改善情况均优于对照组。两组患者治疗前血清中的MDA的含量与正常组相比较明显升高,而血清中的SOD、GSH-Px与正常组相比较明显降低。UTI组患者治疗后较治疗前血清中的MDA有所降低,治疗后第8天与治疗前差异存在显著性(p<0.05)。SOD较治疗前有所升高的,治疗后第8天与治疗前差异存在显著性(p<0.05)。GSH-Px较治疗前有所升高的,治疗后第4天和第8天与治疗前差异存在显著性(p<0.05)。而对照组治疗后各过氧化物指标水平无明显变化,治疗前后差异无显著性。治疗前,乌司他丁组和对照组各指标差异无显著性(p>0.05)。开始治疗以后第4天,乌司他丁组和对照组各指标有差异,但不存在统计意义(p>0.05)。治疗开始后第8天两组病人的各指标之间差异存在统计学意义(p<0.05)。UTI组机械通气时间、ICU住院天数少于对照组,而28 d生存率出现相反趋势。(2)在细胞水平,我们发现LPS刺激后,细胞内的MDA浓度升高,而(GSH Px活力降低,SOD蛋白表达的水平降低,细胞内ROS产生明显增多。UTI处理后可以明显逆转LPS诱导内皮细胞产生的这种效应。UTI可以抑制LPS对内皮细胞刺激引起的JNK/c-Jun的磷酸化。用JNK通路抑制剂SP600125以后,LPS的氧化应激作用明显减弱,JNK、c-Jun的蛋白的磷酸化水平减弱,蛋白的表达降低。结论(1)UTI能够改善脓毒症患者的病情,降低患者机械通气的时间,缩短病患在ICU的住院天数,还能够提高患者28d生存率。作用机制与降低氧化应激损伤有关。(2) 我们的研究结果还显示,乌司他丁可以明显抑制脂多糖对脐静脉内皮细胞的氧化应激损伤通过抑制JNK/c-Jun通路的磷酸化。