【摘 要】
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细菌性脑膜炎是一种严重威胁生命的中枢神经系统（Central nervous system,CNS）疾病,它是由周围脑膜组织感染细菌所引起的。细菌性脑膜炎在养殖业多引发经济损失,也对食品安全和公共卫生造成威胁;在人类,其具有较高的发病率和死亡率,在全世界范围内特别在儿童中,是造成死亡或残疾的主要原因之一。大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）是最常见的引起细菌性脑膜炎的革兰氏阴
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（31772736）,LncRSPH9-4调控致脑膜炎大肠杆菌破坏血脑屏障的作用机制研究,2018.01-2021.12； 国家重点研发计划（2016YFD0500406）,病原入侵中枢神经系统的机制,2016.07-2020.12； 国家自然科学基金青年科学基金项目（31902241）,LncC11orf
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细菌性脑膜炎是一种严重威胁生命的中枢神经系统（Central nervous system,CNS）疾病,它是由周围脑膜组织感染细菌所引起的。细菌性脑膜炎在养殖业多引发经济损失,也对食品安全和公共卫生造成威胁;在人类,其具有较高的发病率和死亡率,在全世界范围内特别在儿童中,是造成死亡或残疾的主要原因之一。大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）是最常见的引起细菌性脑膜炎的革兰氏阴性菌,它也是研究细菌性脑膜炎的常见模式菌株。通常情况下,为了引起脑膜炎,E.coli必须首先在血液中生存,随后接触并穿透血脑屏障（Blood-brain barrier,BBB）,引起炎症反应。尽管细菌性脑膜炎的抗生素疗法对于该病的治疗具有较好的效果,但由于人们对于细菌穿透BBB,破坏BBB完整性以及引起中枢炎症反应的分子机制在很大程度上仍不清楚,其综合死亡率仍然较高,且伴有神经后遗症。在以往,长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lnc RNA）通常被认为是转录过程中的垃圾而不发挥作用。但近年越来越多的研究发现lnc RNA是许多感染性疾病中的重要的调控因子,其调控方式也多种多样。然而,在细菌性脑膜炎尤其是大肠杆菌性脑膜炎中,关于lnc RNA的功能研究较少。本研究基于感染致脑膜炎大肠杆菌（Meningitic E.coli,MNEC）的人脑微血管内皮细胞（Human brain microvascular endothelial cells,h BMECs）中差异表达lnc RNA的测序结果,寻找在MNEC突破BBB的各个环节中具有调控功能的lnc RNA并解析其分子机制。根据调控机制的不同,本文的研究内容如下:1、Lnc C11orf54-1通过激活核因子κB（Nuclear factor kappa-B,NF-κB）信号通路调控中枢炎症。本研究首先在lnc RNA测序结果中鉴定到一条显著下调表达的lnc RNA lnc C11orf54-1,通过Northern blot证实该lnc RNA在MNEC感染过程中被降解产生mg U2-30和mg U2-19,且该降解过程是由易位的RNA酶Coilin蛋白介导的。在功能上,lnc C11orf54-1来源的非编码RNA mg U2-30可以与白介素-1受体相关激酶1（Interleukin-1 receptor-associated kinase 1,IRAK1）相互作用,诱导其寡聚化和自我磷酸化,从而促进NF-κB信号通路的激活。进一步过表达/敲除mg U2-30证实mg U2-30能够在MNEC感染的h BMECs中促进细胞因子的表达,加剧中枢炎症反应。2、Lnc RSPH9-4通过mi R-17-5p/MMP3轴破坏BBB的完整性。本研究发现lnc RSPH9-4在MNEC感染后的h BMECs中显著上调,通过在h BMECs中过表达/敲低lnc RSPH9-4发现它能够介导BBB完整性的破坏。进一步对过表达lnc RSPH9-4的h BMECs进行测序分析,发现总共有639个显著差异表达的m RNA和299个显著差异表达的小RNA（micro RNA,mi RNA）。对这些数据进行生物信息学分析和实验验证,证实lnc RSPH9-4可以通过一种常见的lnc RNA调控方式,即作为分子海绵竞争性结合mi R-17-5p从而上调MMP3表达,而MMP3可以靶向性地降解细胞间紧密连接蛋白（Tight junctions,TJs）,进而破坏h BMECs单层细胞的完整性。证明MNEC所诱导的lnc RSPH9-4可以通过mi R-17-5p/MMP3轴加剧h BMECs中TJs的破坏。3、Lnc MOB3A-2编码的细菌入侵调节小肽（Small regulatory polypeptide of bacterial invasion,SPBI）促进MNEC侵入BBB。此外,本研究首次在感染性疾病中研究了宿主lnc RNA的编码潜能,并在细菌性脑膜炎模型中证实了lnc RNA lnc MOB3A-2的开放阅读框（Open reading frame,ORF）能够编码分子量为9.5 k Da的多肽SPBI,该结果也被我们所制备的抗SPBI抗体所验证。通过黏附侵入试验进一步证实SPBI能够促进MNEC侵入h BMECs,而该效应是由SPBI所促进的h BMECs细胞骨架重排所介导的。由此可以认为,lnc MOB3A-2能够编码多肽SPBI,该多肽促进MNEC侵入BBB。本研究通过lnc RNA作为分子支架结合蛋白,lnc RNA作为分子海绵结合mi RNA以及lnc RNA编码多肽这三个维度解析了lnc RNA调控真核表达的分子机制,阐明了lnc C11orf54-1、lnc RSPH9-4和lnc MOB3A-2这三个lnc RNA在调控MNEC突破BBB并最终引起细菌性脑膜炎的各个关键环节中的作用,为未来开发针对细菌性脑膜炎及其神经后遗症的药物提供新的研究视野与治疗靶点。
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