类风湿关节炎(RA)是常见的慢性自身免疫病之一,目前仍不清楚其确切的发病机制。RA的主要临床表现为小关节局部肿胀疼痛和功能障碍。由于该病引起肌肉关节疼痛和不可逆的关节软骨及骨质的破坏和变形,全世界范围内有许多RA患者失去了基本的自理能力和劳动力,给社会带来了巨大的社会负担和经济负担。虽然研究者们对RA进行了多年的探索,目前仍没有能够持续缓解RA的药物出现。甲氨蝶呤(MTX)作为二氢叶酸还原酶抑制剂,是治疗RA最常用的药物之一,然而根据动物实验和美国风湿协会的研究和统计,MTX治疗RA患者和关节炎模型动物的有效率均在50%左右。目前临床上多采用MTX与其他免疫抑制剂联合治疗,虽然提高了疗效,但不良反应也明显增强。生物制剂例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抑制剂等,虽然治疗效果较好,但是由于耐药性和严重不良反应的出现,限制了其临床应用。因此,揭示MTX治疗有效率不高的原因,寻找提高其疗效和合理应用的方法具有重要临床意义。MTX经典的作用机制为抑制细胞DNA合成,阻止免疫细胞过度活化。近年来有大量研究表明,增加腺苷的分泌,激活腺苷A2A受体(A2AAR)信号产生抗炎作用是MTX治疗RA的重要机制。A2AAR是细胞膜上常见的G蛋白偶联受体(GPCR)之一,其介导的信号可抑制免疫细胞(T/B淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞等)的分化和迁移,同时也可降低白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子和趋化因子的水平。RA是T、B淋巴细胞共同介导的自身免疫病,患者外周血淋巴细胞(PBLs)上A2AAR信号转导的差异是否影响了其对MTX治疗的反应性尚无报道。A2AAR信号主要受G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)的负性调节,当A2AAR被腺苷激活后,GRK2从细胞胞质转移到胞膜上,使受体发生磷酸化,并招募β-arrestin2,启动磷酸化受体的脱敏和内吞过程,从而终止A2AAR信号。本课题比较了MTX治疗有效和无效的RA患者及胶原性关节炎(CIA)大鼠PBLs上A2AAR和GRK2的表达和分布,与疾病活动指标进行相关性分析,阐明PBLs的高水平GRK2胞膜分布是影响MTX治疗有效率的重要因素,同时给予MTX治疗无效CIA大鼠GRK2抑制剂的追加联合治疗,以及在CIA大鼠发病初期以GRK2胞膜表达水平为导向的治疗,揭示抑制GRK2活性对MTX治疗有效率的影响。本课题为揭示RA患者对MTX差异反应的分子基础,指导MTX的临床合理应用提供实验依据。目的:探讨MTX治疗RA患者和CIA大鼠的疗效与PBLs上GRK2和A2AAR胞膜分布的相关性;明确GRK2抑制剂CP-25或帕罗西汀与MTX联合应用对MTX疗效的影响。方法:用II型胶原(2 mg/ml)与卡介苗(4 mg/ml)乳剂诱导Wistar大鼠建立CIA模型,MTX(0.5 mg/kg/3d)治疗21天,每三天观察大鼠体重、全身评分、关节炎指数、关节肿胀度和关节肿胀数。观察CIA对照大鼠的临床症状自然缓解情况,并计算出95%的置信区间。观察MTX治疗大鼠的临床症状缓解范围,如若缓解在CIA大鼠缓解95%置信区间范围内或低于95%置换区间最低值,则表明该临床表现无明显恢复,如若缓解高于CIA大鼠缓解95%置信区间最高值,则表明该临床表现得到有效的恢复。我们共有五个指标(体重,全身评分,关节炎指数,关节肿胀数和足爪容积),如若有3个或大于3个指标能得到明显的恢复(即恢复率大于等于60%)则视为MTX治疗有效(MTX-E),否则为治疗无效(MTX-N),将MTX组分为MTX-E和MTX-N,流式细胞术检测两组大鼠以及MTX治疗有效和无效RA患者PBLs上GRK2和A2AAR的胞质胞膜分布,并与疾病活动度指标进行相关性分析。MTX-N组大鼠追加给予GRK2抑制剂CP-25或帕罗西汀联合治疗,进行整体疗效的评价。H&E染色评价关节病理改变,CCK-8法检测T、B淋巴细胞活力,ELISA法检测大鼠血浆IL-1β、IL-6和TNF-α水平。重新建立大鼠CIA模型,造模成功后检测PBLs上GRK2的胞膜分布情况,给予GRK2胞膜分布较高的CIA大鼠MTX、MTX联合CP-25或MTX联合帕罗西汀治疗,GRK2胞膜分布较低的CIA大鼠给予MTX单独治疗,观察整体指标,比较各给药组的治疗有效率。结果:1.MTX治疗大鼠CIA的有效率为48.65%造模后D14左右,CIA大鼠出现继发侧关节肿胀,开始灌胃给予MTX(0.5mg/kg/3d)治疗,持续21天。CIA模型鼠的体重与正常大鼠相比明显减轻。观察CIA对照大鼠的临床症状自然缓解情况,并计算出95%的置信区间。观察MTX治疗大鼠的临床症状缓解范围,如若缓解在CIA大鼠缓解95%置信区间范围内或低于95%置换区间最低值,则表明该临床表现无明显恢复,如若缓解高于CIA大鼠缓解95%置信区间最高值,则表明该临床表现得到有效的恢复。我们共有五个指标(体重,全身评分,关节炎指数,关节肿胀数和足爪容积),如若有3个或大于3个指标能得到明显的恢复(即恢复率大于等于60%)则视为MTX治疗有效(MTX-E),否则为治疗无效(MTX-N)。根据疗效评判方法,将MTX治疗CIA大鼠分为MTX-E组和MTX-N组,发现MTX对大鼠CIA的治疗有效率为48.65%。MTX-E组大鼠体重恢复较快,同时整体评分、关节炎指数、关节炎肿胀数和足爪容积明显缓解。2.MTX治疗有效和无效组CIA大鼠免疫器官指数和细胞活力的差异与正常大鼠相比,CIA大鼠的脾脏指数明显升高,胸腺指数明显降低。MTX-E组大鼠和CIA大鼠相比,脾脏指数明显降低,胸腺指数升高,MTX-N组没有明显改变;与正常大鼠相比,CIA大鼠T和B淋巴细胞的活力显著增强,MTX-E组大鼠T和B淋巴细胞的活力明显降低。3.MTX治疗有效和无效组CIA大鼠踝关节组织病理学的差异大鼠踝关节组织病理学的改变用H&E法检测,并进行评分。正常大鼠的踝关节病理切面软骨层完整光滑,关节完整无破坏,滑膜细胞均匀少量排列在软骨外侧,CIA大鼠踝关节软骨组织破坏严重,局部有炎症,并有大量的免疫细胞浸润,软骨与异常增生的滑膜粘附在一起,增生的滑膜层中有新血管翳形成;与CIA大鼠比较,MTX-E组大鼠关节炎症、细胞浸润、新血管形成和滑膜异常增生等指标显著降低,软骨组织的破坏显著减少;MTX-N组的大鼠的关节病理与CIA大鼠相比没有明显改善。4.MTX治疗有效和无效组CIA大鼠血浆细胞因子水平的差异与正常组相比,CIA大鼠血浆中的炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平均明显增加。与CIA大鼠比较,MTX-E组大鼠外周血IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌显著减少,MTX治疗无效的CIA大鼠和CIA大鼠比较则没有明显变化。5.CIA大鼠PBLs上GRK2和A2AAR的胞膜表达与足爪容积的相关性分析分离各组大鼠PBLs,流式细胞术检测细胞上A2AAR和GRK2的表达和分布情况。结果显示,与正常大鼠相比,CIA大鼠T和B淋巴细胞胞膜上的A2AAR分布明显减少,MTX治疗有效的可以明显增加A2AAR的分布,MTX治疗无效的则无明显改变。与正常组相比,CIA大鼠T和B淋巴细胞胞膜上的GRK2表达明显上调,MTX治疗有效的GRK2的分布明显低于CIA大鼠,MTX治疗无效的则无明显改变。将MTX治疗大鼠T淋巴细胞膜上A2AAR的表达与足爪容积的相关性分析显示r=-0.5252,p=0.0024;T淋巴细胞膜上GRK2的表达水平与足爪容积进行相关性分析,得出r=0.5059,p=0.0099。提示A2AAR的胞膜表达与MTX的疗效呈显著正相关,T淋巴细胞膜上GRK2表达与MTX的疗效呈负相关。6.RA患者PBLs上A2AAR和GRK2的胞膜表达与疾病活动度指标的相关性分析采集经MTX治疗的RA患者外周血,检测发现,与正常人比较,未治疗的RA患者PBLs上A2AAR的膜表达明显降低,GRK2膜表达明显升高;MTX-E患者PBLs上A2AAR的平均膜表达较高,平均GRK2膜表达较低;MTX-N患者PBLs上A2AAR的膜表达较低,GRK2膜表达较高。相关性分析提示,RA患者PBLs膜上GRK2的分布水平与主要疾病活动度指标类风湿因子(RF),C-反应蛋白(CRP)和血沉(ESR)呈显著正相关。7.帕罗西汀或CP-25追加联合治疗对MTX-N大鼠MTX治疗有效率的影响在继续MTX给药的基础上,给予MTX-N小鼠帕罗西汀或CP-25联合治疗15天。根据继发侧足爪容积的降低值与CIA组进行比较,帕罗西汀+MTX组的治疗有效率升高为77.79%,CP-25+MTX组的治疗有效率升高为88.89%。大鼠踝关节组织病理学的改变用H&E法检测,并进行评分。与CIA大鼠比较,帕罗西汀或CP-25追加联合治疗可以明显抑制MTX-N大鼠的炎症、细胞浸润、新血管形成和滑膜异常增生,显著减少软骨组织的破坏;踝关节组织病理学验证了帕罗西汀或CP-25追加联合治疗对MTX-N大鼠的疗效。提示抑制GRK2活性可以升高MTX的疗效。8.帕罗西汀或CP-25追加联合治疗对MTX-N大鼠免疫器官指数和细胞活力的影响与CIA大鼠比较,MTX-N大鼠脾脏和胸腺指数均没有明显改变。帕罗西汀或CP-25对MTX-N大鼠的追加联合治疗可以明显的抑制其脾脏指数;CP-25对MTX-N大鼠的追加联合治疗可以显著的升高其胸腺指数。与CIA大鼠比较,MTX-N大鼠的T和B淋巴细胞的活力均没有明显变化。帕罗西汀或CP-25对MTX-N大鼠的追加联合治疗可以明显的抑制其细胞活力。9.帕罗西汀或CP-25追加联合治疗对MTX-N大鼠PBLs膜A2AAR和GRK2表达的影响与CIA大鼠相比,MTX-N大鼠PBLs上A2AAR和GRK2的膜表达分布均没有明显改变。帕罗西汀或CP-25对MTX-N大鼠的追加联合治疗可以明显的升高T和B淋巴细胞膜上的A2AAR表达,下调T和B淋巴细胞膜上GRK2的表达。提示可以通过抑制GRK2活性或转膜,增加MTX治疗CIA的有效率。10.以外周血T淋巴细胞GRK2胞膜表达水平为导向的联合CP-25或帕罗西汀治疗对CIA大鼠MTX治疗有效率的影响与正常大鼠相比,根据T淋巴细胞膜上GRK2的表达,对CIA大鼠制定了不同的给药方案,分别为GRK2High-MTX联合CP-25给药组,GRK2High-MTX联合帕罗西汀给药组,GRK2High-MTX给药组和GRK2Low-MTX给药组。根据治疗大鼠足爪容积的缓解与否,判断治疗有效与否。根据继发侧足爪容积的降低值与CIA组进行比较,GRK2Low-MTX给药组有效率为77.7%;GRK2High-MTX联合帕罗西汀给药治疗CIA大鼠的有效率为88.8%;GRK2High-MTX联合CP-25给药有效率为88.8%;GRK2High-MTX单独给药治疗CIA大鼠的有效率为30%。提示给药前检测PBLs上GRK2的胞膜表达,膜表达高的给予GRK2抑制剂可以提高MTX治疗RA的有效率。11.以外周血T淋巴细胞GRK2胞膜表达水平为导向的联合CP-25或帕罗西汀治疗对CIA大鼠踝关节组织病理的影响大鼠踝关节组织病理学的改变用H&E法检测,并进行评分。与CIA大鼠比较,GRK2Low-MTX给药,GRK2High大鼠早期联合MTX和CP-25或帕罗西汀给药可以明显抑制踝关节组织病理学的炎症、细胞浸润、新血管形成和滑膜异常增生,显著减少软骨组织的破坏;GRK2High-MTX单独给药治疗不能显著改善CIA大鼠踝关节组织病理学。12.以外周血T淋巴细胞GRK2胞膜表达水平为导向的联合CP-25或帕罗西汀治疗对CIA大鼠PBLs上A2AAR和GRK2胞膜表达的影响分离各组大鼠PBLs,流式细胞术检测细胞上A2AAR和GRK2表达和分布情况。与CIA大鼠相比,GRK2High大鼠早期联合MTX和CP-25或帕罗西汀给药可以显著升高大鼠T和B淋巴细胞膜上A2AAR水平和明显的降低GRK2表达;MTX单独给药治疗的GRK2High的大鼠A2AAR和GRK2的表达与CIA大鼠没有明显改变;GRK2低表达-MTX给药可以明显升高A2AAR的表达。进一步提示抑制GRK2的膜表达可以提高MTX对CIA大鼠的疗效。结论:1.MTX治疗大鼠CIA的有效率为48.65%;2.CIA大鼠和RA患者PBLs上GRK2膜表达与MTX疗效呈显著负相关,A2AAR膜表达与MTX疗效呈显著正相关;3.联合使用GRK2抑制剂可显著升高MTX治疗大鼠CIA的有效率。