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背景及目的:肝癌是全球第六大常见恶性肿瘤,也是全球癌症相关死亡的第四大原因。由于肝癌早期缺乏特异性的临床症状,且缺乏简便易行的筛查方法,许多肝癌患者在诊断时已进入晚期阶段。而相比于早期肝癌,晚期肝癌可获得的治疗方式有限,预后不良。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是中国人群肝癌发生的首要原因。为此,在慢性乙型肝炎或肝硬化人群中,定期、及早的筛查肝癌显得尤为必要。尿液相比较于血液具有无创、简便、易于操作的特点,是较为理想的生物标志物检测途径,此项研究旨在发掘HBV相关肝癌患者尿液中的新型诊断或筛查生物标志物,并评估其诊断肝癌的效能。目前临床上,运用最为广泛且最为认可的肝癌诊断标志物为甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP),然而AFP在HBV感染的肝癌细胞中的生物学功能尚不清楚,本研究将拟通过进一步的实验加以明确。方法:我们设计了发现队列(n=40)以及验证队列(n=140),收集尿液标本进行生物标志物的研究。其中发现队列包括四个组别:肝细胞癌组(肝癌组,10人),乙肝肝硬化组(肝硬化组,10人),慢性乙型病毒性肝炎组(慢乙肝组,10人)和健康对照组;验证队列包括3个组别:肝癌组(n=75,其中48例为新发肝癌,27例为肝癌术后患者)、肝硬化组(n=51)和慢乙肝组(n=14)。通过同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技术联合高效液相色谱-电喷雾串联质谱法(LC-ESI-MS/MS)鉴定发现队列中肝癌与非肝癌人群的尿液差异表达蛋白(Differentially expressed proteins,DEPs),然后使用组织特异性表达分析工具(Tissue specific expression analysis,TSEA)对这些尿DEPs进行组织来源分析,根据DEPs的变化倍数和一系列生物信息学方法(使用PANTHER数据库进行功能富集实验,使用STRING在线数据库构建蛋白质相互作用网络),找出下一步研究的目标蛋白。通过免疫印迹实验(Western blot)验证尿液中目标蛋白是否存在以及分子量大小。通过酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定尿液中目标蛋白的浓度。为明确AFP在HBV感染的肝癌细胞中的生物学功能,我们通过转染靶向人AFP的shRNA慢病毒进入HepG2.2.15和HepGAD38细胞中,采用定量逆转录-聚合酶链式反应(Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)和Western blot检测AFP的敲低效率,然后通过MTT评估细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,以及Transwell实验测定细胞侵袭和迁移。统计分析:两组目标蛋白的浓度比较采用非参数检验的Mann-Whitney U检验进行分析,使用Pearson相关系数以确定两个连续变量之间的相关性,使用受试者工作特征(Receiver operating characteristic,ROC)曲线来分析评估目标尿蛋白诊断肝癌的效能,两者ROC曲线比较采用Delong检验,P值小于0.05被认为具有统计学意义。结果:通过蛋白质组学技术及分析,我们共鉴定出了96个肝癌尿DEPs,其中74个上调,22个尿蛋白下调。这些蛋白主要为分泌型蛋白,信号通路主要富集在血液凝固、CCKR信号通路、血纤维蛋白溶酶原激活级联反应。通过蛋白质相互作用网络分析,我们确定了15个关键蛋白,分别为:CP,FGA,AFP,CST3,TGOLN2,HSP90B1,VCAN,LTBP1,IGFBP7,ORM1,AMBP,FGB,ORM2,RBP4和CAMP,这些蛋白被认为在肝癌的发生发展中发挥着重要作用。另外,我们通过与既往血液蛋白质组学研究相比较,共有6个蛋白是血液和尿液中共有的,分别是:ORM1,LBP,ANPEP,GSN,AFP和SERPINA3,再整合变化倍数排前10位的DEPs,我们最终确定AFP和α1酸性糖蛋白(Orosomucoid 1,ORM1)作为我们后续的研究目标蛋白。Western blot实验证实尿液中确实存在AFP和ORM1蛋白,其对应的条带位置分别为70kd和45kd,与蛋白的实际分子量大小一致。通过对140例验证队列受试者尿液进行ELISA检测,我们再次验证了肝癌患者中存在相对较高浓度的u-AFP和u-ORM1。结果显示:肝癌组u-AFP水平[109.9(3,3308.9)pg/ml]明显高于肝硬化组[3(3,3)pg/ml,p=0.002]和肝炎组[3(3,3)pg/ml,p<0.001]。u-AFP和血清AFP或AFP-L3存在强相关关系,皮尔森相关系数分别达0.673(p<0.0001)和0.944(p<0.0001),表明u-AFP可能来源于血液循环。肝癌组u-ORM1浓度[1370.6(522.2,10909.2)ng/ml]明显高于肝硬化组[574.6(320,1056.4)ng/ml,p<0.001],但与肝炎组比较差异无统计学意义(p=0.286)。为评估两者的临床应用价值,我们分别绘制了ROC曲线,u-AFP的ROC曲线下面积(AUC)为0.795(95%CI:0.706-0.886),当设定诊断阈值为25.8pg/ml时,u-AFP诊断肝癌的敏感性为63.5%,特异性为95.4%。虽然u-ORM1诊断肝癌的效能较弱,其AUC为0.705(95%CI:0.604-0.807),但当联合u-AFP和u-ORM1时,其诊断效能明显提升,AUC达到0.864(95%CI:0.791-0.937),敏感性为80.9%,特异性为85.5%。另外,我们对u-AFP和u-ORM1做了定性诊断分析,设定u-AFP大于3pg/ml为阳性,u-ORM1大于1284.9ng/ml为阳性。结果显示:单独u-AFP的阳性预测值为90.9%,并行联合u-AFP和u-ORM1的诊断敏感性为85.1%,诊断效能较好,有望进一步开发为诊断试纸条。细胞功能实验表明,敲除AFP可显著抑制HBV感染细胞的增殖、侵袭和迁移。AFP敲低后,细胞上清液中的HBV-DNA下降了约50%,HBsAg无明显变化,而HBeAg上升了约20%,表明AFP对HBV-DNA的复制有明显的促进作用。AFP敲低促进了INFA1和下游基因的表达,包括OAS1,OAS2,ISG15和RNASEL。表明AFP有可能通过抑制IFNα信号通路促进HBV-DNA的复制,虽然这一结论需要得到更多实验的证实。结论:尿AFP是肝癌的潜在诊断或筛查生物标志物,联合尿ORM1可提高其诊断效能,并有希望开发为诊断试纸条。AFP可以促进HBV感染的肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移,并且可能通过抑制IFNα信号传导途径促进HBV-DNA复制。