论文部分内容阅读
第一部分白花丹醌对人视网膜色素上皮细胞增殖与凋亡的影响及机制目的:研究不同剂量白花丹醌对体外培养的人视网膜色素上皮细胞(etinal pigment epithelium,RPE)细胞增殖及凋亡能力的影响。方法:采用体外培养人RPE(ARPE-19)细胞,应用5、15、25μM的白花丹醌作用48h,同时设对照组,以DAPI染色法观察细胞形态及细胞核变化;MTT法检测ARPE-19细胞增殖及凋亡能力;AnnexinV-FITC/PI双标法流式细胞术检测白花丹醌对ARPE-19细胞凋亡的作用;同时检测白花丹醌对ARPE-19细胞周期的影响;并且应用Western Blot法检测Bcl-2家族蛋白变化。结果:白花丹醌处理ARPE-19细胞24h后,可以观察到典型的细胞凋亡的形态学变化,随着药物浓度增加,细胞数量减少,出现大面积细胞缺失,细胞核固缩、核裂解为碎块。MTT结果示白花丹醌对ARPE-19细胞增殖活性有明显的抑制作用,流式细胞仪检测示白花丹醌可以显著促进ARPE-19细胞凋亡,导致ARPE-19细胞G2/M期阻滞,Western Blot结果显示,白花丹醌上调促凋亡蛋白的表达,抑制抗凋亡蛋白的表达,对ARPE-19细胞有诱导凋亡的作用,并且上述效应呈剂量及时间依赖性。结论:白花丹醌对ARPE-19细胞具有抑制增殖和促进凋亡的作用,并呈剂量及时间依赖关系。白花丹醌可以导致ARPE-19细胞发生G2/M期阻滞,在细胞周期出现G2/M期阻滞后,ARPE-19细胞发生凋亡。白花丹醌抑制ARPE-19细胞的增殖,并诱导其凋亡是通过调节Bcl-2家族蛋白发挥生物学效应的。第二部分白花丹醌对人视网膜色素上皮细胞迁移与间质化的影响及机制目的:研究不同剂量白花丹醌对体外培养的人RPE细胞迁移及间质化的影响,评价药物的作用效果。方法:采用体外培养人RPE(ARPE-19)细胞,分为5、15、25μM的白花丹醌及对照组,应用划痕实验检测白花丹醌对ARPE-19细胞迁移能力的影响;侵袭实验观察细胞的侵袭能力;胶原凝胶收缩实验检测RPE使体外胶原胶收缩能力的变化;并且应用Western Blot法检测蛋白基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)MMP-1、MMP-2、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和紧密连接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)的含量变化。结果:白花丹醌处理ARPE-19细胞后,药物浓度越大,划痕实验中的划痕越宽,侵袭实验中穿过人工基底膜的细胞数量越少,胶原胶的收缩抑制越明显,上述三种能力呈浓度依赖性。Western Blot结果示白花丹醌可抑制ARPE-19细胞分泌MMP-1、MMP-2,同时减少了α-SMA的含量,对ZO-1有保护作用,除ZO-1外,白花丹醌对MMP-1、MMP-2、α-SMA的影响呈剂量及时间依赖性。结论:白花丹醌能够抑制ARPE-19细胞迁移及侵袭的能力,并呈剂量依赖关系。白花丹醌能够减轻ARPE-19细胞的上皮间质转化程度,并且抑制其收缩及纤维化的能力。第三部分白花丹醌影响人视网膜色素上皮细胞的相关信号通路研究目的:研究分析白花丹醌作用于ARPE-19细胞的具体信号传导通路。方法:体外培养人RPE(ARPE-19)细胞,应用5、15、25μM的白花丹醌培养48h,应用RT-PCR测定p38 MARK、PI3K、β-catenin和Notch-1的mRNA转录量,应用Western Blot法检测p38 MARK、PI3K、β-catenin和Notch-1的蛋白表达量。结果:对照组相比,中高浓度的白花丹醌均可显著抑制p38 MARK、PI3K mRNA的转录,并且存在剂量及时间依赖关系,而各浓度药物干预组中,β-catenin和Notch-1的mRNA转录量变化无统计学差异。低中高各浓度的白花丹醌均可显著抑制p38 MARK、PI3K蛋白的表达;β-catenin蛋白含量随药物浓度升高呈下降趋势,但只有高浓度白花丹醌组与对照组相比具有统计学意义;而在各浓度药物干预组中,Notch-1的蛋白含量变化均无统计学差异。结论:白花丹醌对ARPE-19细胞的p38 MARK、PI3K信号通路有明显的抑制作用,并呈剂量及时间依赖性,而Wnt/β-catenin、Notch信号通路不是白花丹醌发挥作用的主要通路。第四部分白花丹醌防治兔眼增殖性玻璃体视网膜病变的体内实验研究目的:通过动物模型,研究白花丹醌在兔眼增殖性玻璃体视网膜病变发生发展中的作用,及其眼内注射的有效性和安全性。方法:选取健康成年新西兰白兔,随机分为低浓度25μM白花丹醌组、高浓度50μM白花丹醌及对照溶剂组,玻璃体腔注射对应药物,之后1、3、7、14、21天行裂隙灯、眼底镜检查,第3、7、14、21天分别作暗适应视网膜电图检查,第21天摘取眼球标本做组织学检测,进行白花丹醌兔眼玻璃体腔注射的眼内毒性分析。另外,将视网膜色素上皮细胞及血浆注入兔眼玻璃体腔,建立增殖性玻璃体视网膜病变模型,药物组注射25uM的白花丹醌,对照组注射生理盐水,术后3、7、14、21天进行裂隙灯、眼底镜检查、B超及OCT检查,观察玻璃体及视网膜情况。结果:白花丹醌兔眼玻璃体腔注射后,眼部情况稳定,低浓度25μM白花丹醌组与单纯溶剂对照组的b波振幅较为稳定,高浓度50μM白花丹醌组的b波振幅轻微下降,但差异没有统计学意义。各剂量组眼球行组织学检查见视网膜结构清晰,形态正常。在兔眼增殖性玻璃体视网膜病变模型中,白花丹醌组较生理盐水组的增殖性玻璃体视网膜病变分级较低,白花丹醌组的视网膜脱离率明显低于生理盐水对照组。结论:白花丹醌玻璃体腔内注射可以抑制视网膜色素上皮细胞诱导的兔眼实验性增殖性玻璃体视网膜病变的发生、发展,并且没有明显的毒副作用;白花丹醌在体内和体外实验中均对视网膜色素上皮细胞导致的增殖性玻璃体视网膜病变有抑制作用。