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目的:TPO抗体是甲状腺自身免疫性疾病的重要诊断指标,本研究首先建立天然TPO抗原和TPO抗体的制备工艺,并以此为原料,分别建立新型酶联免疫试剂盒和均相化学发光免疫试剂盒,用于定量检测TPO抗体,并对其临床应用性能进行考察,为自身免疫性甲状腺疾病的诊断提供检测试剂。方法:1.TPO抗原的制备:收集外科手术切除的Grave’s病患者的甲状腺组织,经过组织匀浆,超声粉碎,反复离心,胰蛋白酶的水解,透析等方法制备TPO抗原,粗提物通过亲和层析柱获得TPO纯品,经SDS-PAGE及免疫印迹进行蛋白纯度和免疫活性鉴定。2.TPO抗体的制备:收集TPO抗体>1000IU/mL临床标本,混合,经50%饱和硫酸铵溶液沉淀获得丙种球蛋白,再通过Sephadex 4B-Potein A亲和层析获得IgG,经Abbott公司AXSYM微粒子酶免疫法鉴定TPO抗体的活性,定量作为制备标准品储存液。3.新型酶联免疫试剂盒:将生物素化的牛血清白蛋白包被在微孔板上,再加入链霉亲合素,获得BBA酶标反应板;将生物素标记TPO抗原,制备出生物素化的抗原;经棋盘滴定的方式确定生物素化TPO抗原与酶标抗人-IgG抗体工作浓度;并对反应条件进行优化,同时测定主要方法学参数。4.TPO抗体均相发光免疫测定(竞争法)试剂盒:将TPO抗体包被于受体微球上;制备生物素化TPO抗原;对反应条件进行优化,对试剂盒进行方法学评价。结果:1.TPO抗原的制备:从甲状腺组织中获得了 TPO抗原纯品,经SDS-PAGE鉴定为一条分子量约为55 KD的单一条带,免疫印迹显示能与TPO抗体发生反应。2.TPO抗体的制备:从阳性的血清标本中获得了 TPO抗体的IgG成分,测定蛋白总量512mg,TPO抗体活性为4408 IU/mL。3.新型酶联免疫试剂盒:棋盘滴定结果显示,生物素化TPO抗原的最佳稀释比例为1:6000,IgG-HRP的最佳稀释比例为1:8000。本方法的最适反应温度为37℃,最佳反应时间为30min。本方法的检测灵敏度为0.165IU/mL,批间变异9.0%～9.2%、批内变异6.6%～9.1%,回收率为96%～104%,试剂盒37。℃放置5d保持稳定。4.TPO抗体均相发光免疫测定(竞争法)试剂盒:本实验采用平衡法,包被TPO抗体的受体微球的最佳稀释比例为1:100,包被亲合素的供体微球采用150 ul的加样量。待测抗体与TPO抗体-受体微球的体积比为2:1,最佳反应时间为30min。本方法的检测灵敏度为0.135IU/mL,批间变异6.9%～8.0%、批内变异3.4%～6.2%,回收率为95.6%-103.3%,包被板37℃放置5d保持稳定。结论:1.本实验将TPO抗原成功地从人的甲状腺组织提取纯化出来,建立了一整套较为完善的提取纯化工艺,获得了较高纯度的TPO抗原,通过SDS-PAGE、免疫印迹技术及Abbott公司AXSYM微粒子酶免疫法对TPO抗原的纯度、特异性及免疫活性进行了鉴定,为研制新型的TPO抗体定量测定酶联免疫试剂盒和TPO抗体均相发光免疫测定(竞争法)试剂盒奠定了基础。2.本实验将人血清中的TPO抗体进行了蛋白纯化,提出了 IgG组分,排除了其他组分对本实验的干扰,通过Abbott公司AXSYM微粒子酶免疫法进行了免疫活性鉴定并定量,一方面制备出了 TPO抗体的标准品,另一方面在TPO抗体均相发光免疫测定(竞争法)试剂盒中,我们用从天然的人血清提纯出的TPO抗体包被受体微球。3.新型的TPO抗体定量测定酶联免疫试剂盒适合TPO抗体的测定,不仅节省抗原,降低成本,而且特异性强,操作简单,适合基层医院开展。4.TPO抗体均相发光免疫测定(竞争法)试剂盒无需分离与洗涤步骤,精密度较高,又节省了检测时间,采用了化学发光法,具有很强抗干扰能力,较低背景信号,自动化程度高,适合大型医院开展。