乳腺癌是危害妇女健康的常见恶性肿瘤。近年来，乳腺癌的发病率有不断上升的趋势，并且发病年龄趋于年轻化，使得这一疾病的危害更加显著。在大多数西方国家，乳腺癌已成为女性发病率最高的恶性肿瘤。我国虽不是乳腺癌的高发国家，但发病的增长速度却高出西方国家。 半个世纪以来，乳腺癌的治疗发生了划时代的变化，由单纯手术治疗转变为以外科手术为主，联合放疗、化疗、内分泌治疗等的综合治疗。然而，仍有相当一部分病人在治疗后出现局部复发和远处转移，目前对于这部分患者的治疗效果尚不理想。对于影响乳腺癌进展(复发和转移)因素的深入研究，有助于更加准确预测乳腺癌患者的预后，筛选高危病人，有的放矢地进行治疗，提高患者的远期生存率。 雌激素受体(estrogenreceptor，ER)是影响乳腺癌预后的重要生物学标记。研究表明ER的缺失可导致乳腺癌侵袭性增强，复发率和转移率增加，预后变差。对于出现这种现象的生物学机制，目前还不清楚。近年来随着对细胞因子及信号传导通路研究的逐渐深入，人们发现白细胞介素8(interleukin8，IL-8)与ER的关系极为密切，ER缺失可以上调IL-8的表达。而IL-8作为一种多功能的细胞因子，在多种肿瘤的发生、发展中表现出重要的生物学活性。 但IL-8在乳腺癌组织中的表达情况及其临床意义尚未见报道；其在乳腺癌，特别是ER阴性乳腺癌进展中的具体作用机制仍不明确。ER失活导致的乳腺癌的侵袭性增加是否与IL-8过表达有关?IL-8在ER阴性乳腺癌的侵袭过程中到底起着怎样的作用?IL-8过表达对于ER阴性乳腺癌的预后又会有怎样的影响?为回答这些问题，本研究拟利用组织芯片技术，通过免疫组化法检测IL-8在乳腺癌组织中的表达情况，分析IL-8与乳腺癌各种临床病理因素及预后的关系；通过RNA干扰技术，抑制ER阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-23l的IL-8表达，建立与亲代细胞同源的IL-8低表达乳腺癌细胞系，观察IL-8对ER阴性乳腺癌细胞增殖、黏附、侵袭以及基质金属蛋白酶表达等恶性表型的影响情况；通过建立乳腺癌荷瘤裸鼠模型，进一步探讨IL-8在体内对ER阴性乳腺癌肿瘤生长、组织学分级、血管生成和转移等的作用。我们期待通过本研究，能够对IL-8在ER阴性乳腺癌中的作用进行系统、全面的分析，明确其在ER阴性乳腺癌进展中的作用机制，为进一步研究ER阴性乳腺癌的生物学特性、改善临床治疗效果打下基出。 材料与方法 选取手术切除的乳腺癌、乳腺纤维腺瘤及正常乳腺组织石蜡标本为研究对象，每例标本取2个代表性位点，建立含134例乳腺癌、20例乳腺纤维腺瘤和20例正常乳腺组织的组织芯片。分别对组织芯片进行IL-8、ER、PR、C-erbB-2、Ki67、CD34免疫组化染色，结合临床病理资料，分析IL-8在乳腺癌组织中的表达与年龄、组织学类型、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移以及乳腺癌主要生物学指标的关系；结合随访资料，进一步探讨IL-8表达与乳腺癌预后的关系。 将IL-8siRNA重组质粒pRNA-IL-8以脂质体法转染ER阴性人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231，G418法筛选阳性转染克隆，通过RNA干扰技术构建与MDA-MB-231同源的IL-8低表达细胞系；采用半定量RT-PCR法和ELISA法分别从mRNA水平和蛋白水平对转染前后细胞的IL-8表达情况进行检测，确定RNA干扰效果。采用MTT法检测转染前后细胞的增殖及黏附能力，流式细胞仪检测细胞周期，TUNEL法检测细胞凋亡，Transwell法检测细胞侵袭能力，并采用RT-PCR和Westernblot法检测转染前后细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)mRNA和蛋白的表达情况。 建立ER阴性乳腺癌荷瘤裸鼠模型，比较转染前后细胞在体内的致瘤性、生长速度以及转移情况。对肿瘤标本进行HE染色，观察肿瘤的组织学分级及炎症细胞浸润情况；通过CD34免疫组化染色，检测肿瘤的微血管密度(MVD)。 应用SPSS12.0统计软件包对量化数据进行统计学分析。 第一部分.IL-8在乳腺癌组织中的表达及与预后的关系IL-8在乳腺癌组织中的阳性表达率为27.4％，明显高于在乳腺良性肿瘤(5.3％)及正常乳腺组织(0％)中的表达(p=0.002)。IL-8表达与乳腺癌组织学类型(p=0.040)和淋巴结转移(p=0.021)有关；IL-8阳性率与ER、PR表达呈负相关(p=0.015、p=0.034)，与C-erbB-2表达呈正相关(p=0.002)。IL-8表达阳性组与阴性组的5年无瘤生存率分别为63.89％和87.08％，差异有统计学意义(p=0.031)。 第二部分.利用RNA干扰技术建立IL-8低表达的ER阴性乳腺癌细胞系将转染前后各组细胞的RT-PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，经图像分析发现：pRNA-IL-8转染组IL-8mRNA表达与阴性对照组(p=0.003)和空白对照组(p=0.045)相比明显下调，而两个对照组间IL-8mRNA表达无显著性差异(p=0.121)。转染前后细胞上清液ELISA检测结果发现：pRNA-IL-8转染组IL-8浓度明显低于两个对照组(p＜0.001)，相对浓度仅为空白对照组的10.24％，而两个对照组间IL-8浓度没有显著性差异(p=0.209)。 第三部分.IL-8对ER阴性乳腺癌细胞恶性表型影响的体外实验转染前后细胞生长曲线基本平行，不同时间点各组细胞数无显著性差异(p＞0.05)。转染前后细胞在G1期(F=0.035，p=0.966)、G2期(F=2.612，p=0.153)、S期(F=3.336，p=0.106)分布、G2/G1(F=0.612，p=0.573)以及凋亡指数(x2=0.114，p=0.945)均无显著性差异。细胞间黏附能力pRNA-IL-8转染组明显高于对照组(F=18.629，p＜0.001)；基质黏附能力pRNA-IL-8转染组明显低于对照组(F=19.974，p＜0.001)。pRNA-IL-8转染组侵袭重建基底膜能力显著低于对照组(F=28.011，p＜0.001)。pRNA-IL-8转染组MMP-2mRNA和蛋白的表达与对照组相比均明显下调(p=0.003，p＜0.001)。 第四部分.IL-8对ER阴性乳腺癌恶性表型影响的体内实验转染前后乳腺癌细胞的成瘤率和肿瘤组织学分级没有显著性差异，但pRNA-IL-8转染组移植瘤在裸鼠体内生长速度明显快于对照组。干扰组炎症细胞浸润数明显少于对照组(p=0.001，p＜0.001)，而两个对照组间无显著性差异(p=1.000)。pRNA-IL-8转染组的肿瘤转移率明显低于空白对照组(0％vs80％，p=0.048)。CD34标记的MVD，pRNA-IL-8转染组明显低于对照组(F=83.306，p＜0.001)，而两个对照组间MVD无显著性差异(p=0.470)。 结论 1.IL-8在乳腺癌组织中的表达率明显高于乳腺良性肿瘤和正常乳腺组织，在浸润性乳腺癌中的表达率高于非浸润性癌。 2.乳腺癌组织中IL-8表达与淋巴结转移及C-erbB-2表达呈正相关，与ER、PR表达呈负相关，是影响无瘤生存率的不利因素。 3.IL-8在体外不影响ER阴性乳腺癌细胞的自主生长增殖，但在裸鼠体内可以抑制原发移植瘤的生长。 4.IL-8在体外和体内均可促进ER阴性乳腺癌的侵袭和转移。 5.IL-8在裸鼠体内可促进ER阴性乳腺癌的血管生成。 6.IL-8促进ER阴性乳腺癌转移和血管生成的作用可能与其上调MMP-2的表达有关。 7.IL-8在体内抑制ER阴性乳腺癌生长和促进癌细胞转移的作用可能与其介导的炎症细胞浸润有关。